安福濤，謝瑾卉，林 英，于舒怡，臧超群，梁春浩

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，沈陽 110161）

由葡萄生單軸霉［Plasmopara viticola（Berk. et Curtis）Berl.et de Toni］引起的葡萄霜霉病是一種世界性病害，在全世界各大葡萄產(chǎn)區(qū)均發(fā)生普遍［1］。該病主要為害葉片，也能為害一些幼嫩組織，如新梢、花序、穗軸、卷須等［2］。使用化學農(nóng)藥一直是防治該病的主要手段，但是長期大量連續(xù)使用化學農(nóng)藥，不僅對環(huán)境造成污染，而且危害人畜健康［3］。現(xiàn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出到2020 年化肥農(nóng)藥使用量零增長行動，提倡和鼓勵植物病害要采用綠色環(huán)保的方式進行防治。因此，利用生物防治措施來防控葡萄霜霉病具有重要現(xiàn)實意義。

活性蛋白和小分子抗菌素是生防細菌分泌的主要抑菌物質(zhì)［4］。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliq?uefaciens）MET0908 分泌的抑菌蛋白對西瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）具有較強抑制作用，抑菌蛋白能夠進入病菌菌絲，并集中在菌絲隔膜部位，通過分解病菌細胞壁，導致細胞降解和破裂，從而使病菌喪失侵染活性［5］。堅強芽孢桿菌（Bacillus fir?mus）ZP-1 對多種植物病原菌具有抑制活性，從其代謝產(chǎn)物中分離純化的抗菌活性蛋白P1和P2經(jīng)鑒定分別為幾丁質(zhì)酶和枯草芽孢蛋白酶［6］。從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）W-118 菌株中分離純化的抑菌蛋白被鑒定為幾丁質(zhì)酶，其對瓜果枯萎病菌（Fu?sarium oxysporum）具有較強抑菌活性［7］。蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）SY286 為遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所生物防治研究室分離和保存的1 株對葡萄霜霉病菌具有較強抑制活性的生防菌株，并已證實其發(fā)酵液中胞外蛋白的主要作用，本研究擬對從SY286 菌株發(fā)酵濾液中分離的粗提蛋白穩(wěn)定性進行分析，為SY286 菌株抑菌蛋白的分離、純化以及后續(xù)生防制劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L；蛋白胨5 g/L；酵母膏1 g/L；葡萄糖 10 g/L；瓊脂粉 12～15 g/L；pH 7.0～7.2。

SY286 菌株發(fā)酵用培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L；牛肉膏7.5 g/L；硝酸鉀5 g/L；氯化鈉2.5 g/L；pH 7.0。

1.1.2 供試菌株 蒼白桿菌SY286 和葡萄霜霉病病菌（Plasmopara viticola）均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所生物防治研究室分離保存。

1.1.3 供試試劑 0.02 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.8）：A 液，0.2 mol/L NaH2PO4；B 液，0.2 mol/L Na2HPO4，取A 液 51 mL 加入到 49 mL B 液中，置于容量瓶中，加去離子水定容至2 L。

1.2 方法

1.2.1 SY286 菌株發(fā)酵濾液制備 將SY286 菌株接入NA 培養(yǎng)基平板上，27 ℃培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取活化的菌株接到裝有100 mL NA 培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，27 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，獲得SY286菌株發(fā)酵液，發(fā)酵液12 000 r/min、4 ℃離心30 min，上清液經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾，獲得發(fā)酵濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SY286 菌株抑菌蛋白的提取

1）抑菌蛋白的提取。透析袋預處理［8］，每處理取SY286 發(fā)酵濾液1 L，緩慢加入固體硫酸銨（邊加邊攪拌）至飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min 離心20 min，棄去上清液。將不同飽和濃度獲得的沉淀經(jīng)透析脫鹽后，用0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液將每種粗提物定容至相同體積，采用離體葉片法測定每個處理粗提物的抑菌活性，以確定最佳硫酸銨飽和度。

2）粗提物活性測定。采用離體葉片法對不同飽和度硫酸銨粗提物的活性進行測定，具體參照文獻［9］。采集相同葉齡及大小一致的健康葡萄葉片（品種為無核白雞心），無菌水沖洗干凈，葉柄用潤濕脫脂棉包被，背面朝上置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中。取1 mL 105個/mL 的葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液均勻噴布在葉片背面，24 h 后噴布1 mL 不同飽和度硫酸銨沉淀的抑菌蛋白粗提物溶液，用封口膜將培養(yǎng)皿密封。22 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察結(jié)果。每個處理10 片葉片，3 次重復，計算抑菌效果，以確定最佳硫酸銨飽和度。

葉片分級方法［10］：0 級，無病斑；1 級，病斑面積占整個葉面積的5%以下；3 級，病斑面積占整個葉面積的6%～25%；5 級，病斑面積占整個葉面積的26%～50%；7 級，病斑面積占整個葉面積的51%～75%；9 級，病斑面積占整個葉面積的75%以上。抑菌效果通過病情指數(shù)計算：

1.2.3 抑菌粗提蛋白穩(wěn)定性測定

1）抑菌粗提蛋白溶液配制。取抑菌粗提蛋白，用0.02 mol/L 的磷酸緩沖液將抑菌粗提蛋白配制成1 mg/mL 的蛋白溶液，備用。

2）溫度對抑菌粗提蛋白質(zhì)的活性影響。取抑菌粗提蛋白溶液240 mL，分成8 等份，將上述蛋白溶液分別在 5、10、20、25、30、40、50、80 ℃環(huán)境中靜置30 min。參照“1.2.2”的方法測定不同溫度對蛋白質(zhì)溶液抑菌活性的影響。

3）pH 對抑菌粗提蛋白的活性影響。取抑菌粗提蛋白溶液330 mL，分成11 等份，將上述蛋白溶液用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 將 pH 分別調(diào)至 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，于 4 ℃靜置 48 h，參照“1.2.2”的方法測定不同酸堿度對蛋白溶液抑菌活性的影響。

4）紫外線對抑菌粗提蛋白質(zhì)的活性影響。取抑菌粗提蛋白溶液210 mL，分成7 等份。將上述蛋白溶液分別在 20 W 紫外燈下照射 0、2、4、6、8、10、12 h。參照“1.2.2”的方法測定紫外線對蛋白溶液抑菌活性的影響。

5）蛋白酶對抑菌粗提蛋白的活性影響。取抑菌粗提蛋白溶液120 mL，分成4 等份。分別用1 mg/mL蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理上述蛋白溶液，37 ℃靜置1 h。參照“1.2.2”的方法測定蛋白酶對蛋白溶液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨飽和度的確定

經(jīng)不同飽和度的硫酸銨鹽析出的抑菌粗提蛋白對葡萄霜霉病菌的抑制效果有明顯差異，如圖1 所示。經(jīng)60%硫酸銨溶液鹽析出的抑菌粗提蛋白對葡萄霜霉病菌的抑菌活性最強，明顯高于其他飽和度硫酸銨鹽析出的抑菌粗提蛋白的抑菌活性，抑菌率可達81.98%。60%飽和度的硫酸銨適宜提取SY286菌株發(fā)酵液中的抑菌蛋白。

圖1 不同硫酸銨飽和度鹽析出的抑菌粗蛋白對葡萄霜霉病菌的抑菌效果

2.2 抑菌粗提蛋白的穩(wěn)定性

2.2.1 溫度對抑菌粗提蛋白的活性影響 在5～50 ℃的環(huán)境中，粗提蛋白溶液的抑菌活性較穩(wěn)定，當溫度高于50 ℃時，其抑菌活性明顯降低（圖2）。建議將該菌制成生防制劑時，應(yīng)保存在低于50 ℃的環(huán)境中。

圖2 溫度對粗提蛋白抑菌活性的影響

2.2.2 pH 對抑菌粗提蛋白活性的影響 pH 對SY286 菌株抑菌粗提蛋白抑菌活性具有明顯影響，當pH 在4～10 時，抑菌粗提蛋白抑菌活性較穩(wěn)定；當粗提蛋白經(jīng)過酸（pH＜4）或過堿（pH＞10）處理后，其抑菌活性明顯降低（圖3）。說明抑菌粗提蛋白不宜在過酸或者過堿環(huán)境中儲存。

圖3 pH 對粗提蛋白抑菌活性的影響

2.2.3 紫外線對抑菌粗提蛋白活性的影響 紫外線對粗提蛋白活性具有一定的影響。粗提蛋白溶液隨著紫外燈照射時間的增加，其活性逐漸降低（圖4）。說明抑菌粗提蛋白應(yīng)在陰涼處保存。

圖4 紫外線對粗提蛋白抑菌活性的影響

2.2.4 蛋白酶對抑菌粗提蛋白活性的影響 蛋白酶對SY286 抑菌粗提蛋白活性影響明顯。粗提蛋白溶液經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后，抑菌活性均明顯下降（圖5）。

圖5 蛋白酶對抑菌粗提蛋白抑菌活性的影響

3 小結(jié)與討論

生防菌的利用方式主要有2 種，一種是將其制備成活菌制劑使用，另一種是通過發(fā)酵，利用其產(chǎn)生的抑菌活性產(chǎn)物［11］。利用飽和硫酸銨沉淀法進行鹽析，是從生防菌發(fā)酵濾液中提取蛋白質(zhì)類物質(zhì)的常用方法，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)60%飽和度的硫酸銨鹽析出的蛋白質(zhì)對葡萄霜霉病菌的抑制活性最強，抑菌率達81.98%。有研究表明，硫酸銨濃度達60%時能鹽析出大部分活性蛋白質(zhì)［12，13］。安霞［14］研究證實，蒼白桿菌H10 能夠產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶等水解酶類，該菌對多種植物病原真菌具有明顯的抑制作用，并能夠降解多種農(nóng)藥殘留。陳夕軍等［15］利用飽和硫酸銨沉淀法，從水稻內(nèi)生枯草芽孢桿菌G87 中分離純化1 種分子質(zhì)量約為50.8 kD 活性糖蛋白，并證實經(jīng)堿性和高溫處理會降低其穩(wěn)定性。研究通過對蒼白桿菌SY286 的抑菌蛋白進行初步分離和穩(wěn)定性分析，結(jié)果顯示，抑菌活性蛋白對溫度、酸堿度和紫外線均有較大的耐受范圍，但是對各類蛋白酶均較敏感，研究結(jié)果為更好地利用該生防菌株奠定了基礎(chǔ)。