薛 昊，蘇婧鈺，陳文君，申雨玫，王可軒，李 鑫，陳 靖,3*，楊 波*

1哈爾濱商業(yè)大學藥學院，哈爾濱 150076；2揚州大學醫(yī)學院(轉化醫(yī)學研究院)；3江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室，揚州 225001

瘧疾是一種由瘧原蟲引起、按蚊傳播且在世界范圍內廣泛流行的一種致死率很高的惡性傳染病，瘧原蟲的循環(huán)性傳播及其復雜的生命周期，使瘧疾一直難以徹底根除,大多數(shù)傳統(tǒng)抗瘧藥如氯喹、奎寧、伯氨喹和哌喹等都先后出現(xiàn)耐藥性而失效，而青蒿素(artemisinin，ART)類抗瘧藥作用迅速，目前公認毒性較低，尚未出現(xiàn)明顯耐藥性而成為一線抗瘧藥[1,2]。ART為黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)葉中提取的一種倍半萜內酯類化合物[3,4]，不僅是目前治療瘧疾的唯一一線抗瘧藥物[5,6]，還具有抗病毒、免疫調節(jié)、抗炎、抗寄生蟲、抗真菌及抗腫瘤等多種生物活性[7-12]，但由于其水溶性和脂溶性均較差，屬難溶性藥物，體內吸收不完全，生物利用度較低，為有效解決這些制約青蒿素臨床應用的難題，近年來很多新方法被運用到青蒿素類藥物制劑中，其中固體分散體技術得到了人們的關注。

固體分散體(solid dispersion，SD)是將固體疏水原料藥以分子或微晶態(tài)分散在固體親水性惰性載體中所形成的分散系統(tǒng)[13]，可顯著增加藥物溶解度與溶出度，促進藥物的口服吸收，提高生物利用度[14]，還可通過選用適宜的載體及輔料，使藥物較為穩(wěn)定的高度分散甚至進一步達到緩控釋效果。Ansari等[15]以PVP K30為單載體制備了二氫青蒿素固體分散體，發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素與載體以非晶體復合物存在，溶解度比原料藥增加了50倍；Yang等[16]以泊洛沙姆188為最佳載體制備了吳茱萸堿固體分散體，可在不影響藥物含量與形態(tài)的基礎上大大提高藥物的溶出；Li等[17,18]分別以PEG 6000-卵磷脂為雙載體和Ⅲ號丙烯酸樹脂為單載體制得ART固體分散體(ART-SD)和緩釋型ART-SD。與單一載體相比，雙載體或二種以上載體組成混合載體制備固體分散體在調節(jié)藥物釋放速度及改善藥物溶出度方面可能更具優(yōu)勢[19]，但目前為止載體類型是否對ART溶出度存在影響尚不明確，且以雙載體制備速釋型ART-SD工藝條件也未得到優(yōu)化。本文選用固體分散體常用載體卵磷脂與PEG 6000或PVP K30為雙載體，比較了不同載體類型及比例對藥物溶出度的影響，優(yōu)化了雙載體速釋型ART-SD制備工藝，并通過IR、DSC方法明確最優(yōu)處方制備的固體分散體中藥物-載體的存在狀態(tài)，為提高難溶性藥物臨床療效奠定重要基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

ART(純度>98%，批號：20190112)購于阿拉丁試劑有限公司；PVP K30、氫氧化鈉購于國藥集團化學試劑有限公司；PEG 6000購于北京化工廠天津市福晨化學試劑廠；大豆卵磷脂購于上海藍季科技發(fā)展有限公司；無水乙醇購于天津市科密歐化學試劑有限公司；以上原輔料和試劑均為分析純，藥用輔料標準符合《中國藥典》(2020版)相關規(guī)定。

1.2 儀器

LE204E102電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；RE-52CS旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；RCZ-6B2型智能溶出度試驗儀(山東利達信儀器儀表設備有限公司)；200F3差示掃描量熱儀(德國Netzsch公司)；Lambda750紫外分光光度計(Perkin Elmer 公司)；DZF-6050真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 ART-SD制備

溶劑法制備：按一定質量比精密稱取ART與載體材料(大豆卵磷脂、PVP K30或PEG 6000)適量，加入到適量95%乙醇中溶解，并在20 ℃下攪拌30 min后，將其置于旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸去溶劑至粘稠，于真空干燥箱50 ℃干燥24 h，最后將樣品置于預先清洗的研缽中，研磨均勻后，過80目篩，密封并于4 ℃保存。

2.1.2 物理混合物(physical mixture，PM)

按一定質量比精密稱取ART與載體材料適量，過80目篩，室溫下置于研缽內攪拌至混合均勻即得，密封并4 ℃保存。

2.2 固體分散體中ART定量分析

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 ART標準品溶液配制

精密稱取ART對照品5.00 mg，置于50 mL量瓶中，加入95%乙醇充分溶解并定容，即為0.1 mg/mL對照品貯備液。

分別精密吸取ART對照品貯備液1、2、4、6、8 mL于50 mL量瓶中，依次加入95%乙醇9、8、6、4、2 mL，0.2% NaOH溶液定容至50 mL，分別配成系列濃度分別為2、4、8、12、16 μg/mL的標準品溶液，50 ℃水浴加熱0.5 h，迅速取出冷卻，備用。

2.2.1.2 輔料空白溶液配制

精密稱取大豆卵磷脂、PVP K30與PEG 6000各5.00 mg，按照“2.2.1.1”項下配制輔料空白溶液。

2.2.1.3 供試品溶液配制

精密稱取ART-SD適量(0.100 0 g)，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇待充分溶解后定容至刻度。精密吸取該樣品母液6 mL，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇4 mL，0.2% NaOH溶液定容至50 mL，50 ℃水浴加熱0.5 h，迅速取出冷卻，配制成ART-SD供試品溶液，備用。

2.2.2 檢測波長選擇

以1 mL 95%乙醇與9 mL 0.2% NaOH混合液作為空白對照，掃描波長范圍200～500 nm，測定載體材料及ART對照品溶液吸收曲線，確定反應產物最大吸收波長，并考察載體材料是否對主藥檢測存在干擾。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 標準曲線制備

按照“2.2.2”項下確定的最適波長進行測定，以1 mL 95%乙醇與9 mL 0.2% NaOH混合液作為空白對照，測定不同濃度標準品溶液經反應后的吸光度值，以濃度(C)-吸光度(A)繪制標準曲線。

2.2.3.2 精密度試驗

取“2.2.1.1”項下16 μg/mL的標準品溶液，在最大吸收波長處于紫外分光光度計上連續(xù)測定吸光度值6次，計算日內精密度(RSD)。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1.1”項下16 μg/mL的標準品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，測定吸光度值，計算RSD。

2.2.3.4 重復性試驗

精密稱取同一批次ART-SD適量(含ART 5.00 mg)，取3份，按“2.2.1.3”項制備供試品溶液，測定吸光度值，標準曲線法測得樣品中ART濃度，并計算平均百分含量和RSD。

2.2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量ART-SD樣品9份(0.15 g)，分別加入高(12.0 μg/mL)、中(8.0 μg/mL)、低濃度(4.0 μg/mL)標準品溶液各3份適量，按“2.2.1.3”項制備供試品溶液，計算平均加樣回收率(%)和RSD。

2.2.3.6 樣品含量測定

取“2.2.1.3”項制備的供試品溶液，平行測定3次，標準曲線法測定樣品中ART濃度，分別按理論投料量及原料藥占制劑質量百分比，計算樣品中ART百分含量(%)及RSD。

2.3 體外溶出度的測定

ART-SD溶出度測定：根據(jù)2020版《中國藥典》第四部漿法通則。待溶出介質(超純水900 mL)溫度穩(wěn)定為37 ℃，取適量ART-SD(相當于ART20 mg)粉末置于超純水中，轉速為100 rpm。分別于10、20、30、40、50 min取樣5 mL，及時補充溶出介質5 mL，樣品0.45 μm濾膜過濾。得續(xù)濾液適量，按上述含量測定方法測定ART濃度，計算累積溶出度并繪制溶出曲線。

2.4 處方篩選與優(yōu)化

2.4.1 載體種類

按照8∶1固定比例精密稱取載體混合物和ART(分別以大豆卵磷脂與PEG 6000或大豆卵磷脂與PVP K30比例為1∶7作為載體混合物)，按“2.1.1”項制備，考察載體種類對ART-SD溶出的影響。

2.4.2 大豆卵磷脂∶PVP K30復合載體比例

固定ART與大豆卵磷脂比例為1∶1，大豆卵磷脂和PVP K30比例分別為1∶5、1∶7、1∶9，按“2.1.1”項制備ART-SD，并考察復合載體比例對ART溶出度影響。

2.4.3 攪拌時間

載體∶藥物固定比例為8∶1，復合載體比例選取大豆卵磷脂與PVP K30比例為1∶7，選取攪拌時間分別為20、30、40 min，考察反應時間對ART溶出度影響。

2.4.4 溶劑用量

載體∶藥物固定比例為8∶1，復合載體比例選取大豆卵磷脂與PVP K30比例為1∶7，分別加入到溶液體積分別20、30、40 mL的95%乙醇中，按“2.1.1”項制備，并考察溶劑用量對ART溶出度影響。

2.5 物相表征

2.5.1 差示掃描量熱法(DSC)

將ART、PVP K30、大豆卵磷脂、PM及ART-SD粉末分別進行DSC分析。以一只坩堝作為空白參比，另一只坩堝中放入5.00～6.00 mg樣品，測量條件：氛圍氣為氮氣，10 ℃/min升溫，溫度范圍20～200 ℃掃描，得到不同樣品的DSC曲線。

2.5.2 紅外光譜(IR)

采用溴化鉀壓片法將ART、PVP K30、大豆卵磷脂、PM及ART-SD粉末分別制備成樣品后進行紅外掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，得到不同樣品的紅外光譜，進行光譜分析。

2.6 統(tǒng)計方法

3 結果與分析

3.1 檢測波長的確定

由圖1A可以看出，ART在292 nm處吸光度最強，僅在紫外區(qū)203 nm處有較弱的末端吸收，這是由于50 ℃時ART在0.2% NaOH溶液中，定量生成α，β-不飽和酮酸鹽，得到一吸收峰在292 nm處的產物。而由圖1B、C、D可以看出，輔料在292 nm處無吸收，對測定無干擾，故本實驗選擇292 nm為ART含量檢測波長。

圖1 紫外掃描圖

3.2 方法學考察

3.2.1 標準曲線的繪制

不同濃度標準品吸光度值見表1，標準曲線如圖2，回歸方程為：A=0.055C+0.108 5，r2=0.999 6(n=5)，結果表明ART在2.0～16.0 μg/mL范圍內濃度與吸光度線性關系良好。

圖2 ART標準曲線

表1 不同濃度標準品吸光度值

3.2.2 精密度

如表2所示精密度實驗結果，RSD小于1%，表明方法精密度良好。

表2 精密度實驗(n=6)

3.2.3 穩(wěn)定性

如表3穩(wěn)定性實驗結果，RSD小于1%，表示測定標準品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性測定結果(n=8)

3.2.4 重復性

如表4重復性實驗結果，按理論投料量或占總制劑含量計算RSD均小于2%，表明方法重復性良好。

表4 重復性測定結果(n=5)

3.2.5 加樣回收率

如表5所示，低、中、高濃度的溶液平均加樣回收率分別為98.33%、98.11%、98.12%，RSD小于2%，符合方法學要求。

表5 加樣回收率(n=3)

3.3 含量測定

由表6數(shù)據(jù)可知，按“2.2.1.3”項制備的ART-SD中ART含量均值按理論投料量計算為94.97%±0.31%，按原料藥占制劑總質量百分比為10.55%±0.04%，RSD為0.28%。

表6 ART-SD中ART含量測定結果(n=3)

3.4 處方優(yōu)化結果

3.4.1 雙載體種類篩選

由圖3和表7可以看出，在50 min內，使用大豆卵磷脂和PVP K30作為雙載體的溶出度和溶出速率均高于大豆卵磷脂和PEG 6000，故選擇大豆卵磷脂和PVP K30為復合載體。

表7 不同雙載體影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

圖3 不同雙載體影響ART累積溶出曲線

3.4.2 復合載體比例篩選

由圖4和表8可以看出，溶出速率和溶出度均有差異，且在溶出30 min后，溶出度趨于穩(wěn)定。當大豆卵磷脂和PVP K30比例低于1∶7時，固體分散體的溶出度和溶出速率與載體比例成正比。當大豆卵磷脂和PVP K30比例高于1∶7時，固體分散體的溶出速率和溶出度基本不變，分析原因是青蒿素已充足分散于載體中，故增加PVP K30用量對分散度無影響。故選擇混合載體大豆卵磷脂和PVP K30比例為1∶7。

表8 不同載體比例影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

圖4 不同載體比例影響ART溶出曲線

3.4.3 攪拌時間篩選

由圖5和表9可以看出，攪拌時間在20～30 min之間時，隨著攪拌時間的延長，溶出度也隨之增加。但攪拌時間在30～40 min之間時，溶出度基本無變化。分析原因可能是當攪拌時間小于30 min時，ART部分以微晶形式存在，達到30 min后，ART多以無定型形態(tài)分散于載體中，故選擇30 min為反應時間。

圖5 不同攪拌時間影響ART溶出曲線

表9 不同攪拌時間影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

3.4.4 溶劑用量篩選

由圖6和表10可以看出，當ART和載體充分溶解在溶劑中，在一定限度內，溶劑量的增加并不會影響溶出度。考慮到成本及安全性，故選擇95%乙醇量為20 mL。

表10 不同溶劑用量影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

圖6 不同溶劑用量影響ART溶出曲線

3.4.5 ART-SD最優(yōu)處方

通過上述實驗，ART-SD最優(yōu)處方為：稱取50 mg ART，50 mg大豆卵磷脂，350 mgPVP K30(ART∶大豆卵磷脂∶PVP K30 = 1∶1∶7)，溶于20 mL 95%乙醇中，攪拌30 min后于旋轉蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至粘稠后置于真空干燥箱中，50 ℃干燥24 h，研磨均勻后，過80目篩后，密封并在4 ℃冰箱保存。

3.4.6 最優(yōu)處方驗證

由圖7和表11可知ART-SD在30 min內快速溶出，30 min后達到溶出平衡，總溶出度超過87%，且三批樣品的溶出曲線一致，說明該方法制劑重現(xiàn)性良好。ART原料藥50 min內溶出度小于0.06%，說明雙載體制備的速釋型ART-SD能顯著提高ART溶出度。

圖7 不同批次制備ART-SD和ART原料藥溶出度曲線差異

表11 不同批次制備ART-SD和ART原料藥累積溶出百分率測定結果(n=3)

3.5 物相表征

3.5.1 體外溶出對比

由圖8不同樣品的溶出曲線可以看出，在50 min內，ART原料藥在溶出介質中不溶，制備成ART-SD后，明顯改善了溶出度。相比于ART原料藥，物理混合物(PM)中藥物的溶出度基本不變，說明載體對主藥只起到輕微的助溶作用。

圖8 青蒿素固體分散體、物理混合物及原料藥累積溶出曲線差異

3.5.2 差示掃描量熱法(DSC)

由圖9可見，ART在152.6 ℃存在尖銳的吸熱峰，PVP K30在108 ℃左右有一個峰寬不對稱的吸收峰，由于它是親水性聚合物，在該溫度下脫水而產生的峰。大豆卵磷脂沒有明顯的吸收峰，由于它具有無熔點且無固定形態(tài)的特性。PM在150 ℃和105 ℃附近有兩個吸收峰，說明ART與載體只是混合且并未改變晶型。ART-SD無明顯吸收峰，說明藥物晶型發(fā)生了改變，載體與ART間形成了固體分散體。

圖9 差示掃描圖

表12 青蒿素固體分散體、物理混合物及原料藥累積溶出百分率測定結果(n=3)

3.5.3 紅外光譜法(IR)

由圖10可見，ART在1 738、1 116、724、2 870～3 000、1 450～1 380 cm-1有吸收峰，分別是C=O、C-O-C、O-O、C-H，C-H鍵的伸縮振動；只有1 738 cm-1的C-O伸縮振動峰較強，峰形較好，周圍無其他干擾峰。PVP K30在1 655、2 950、1 289 cm-1有吸收峰，分別是C=O的伸縮振動、C-H的伸縮振動、C-N的伸縮振動，在3 446 cm-1寬且強的吸收峰是由于分子吸收了水分。大豆卵磷脂在1 738 cm-1有吸收峰(C=O的伸縮振動)。PVP分子和大豆卵磷脂中均有羰基，因而可以和ART分子中苯環(huán)上的氫形成氫鍵。PM的羰基峰仍與PVP分子和大豆卵磷脂一致(1 655、1 738 cm-1)，說明ART與載體只是簡單的混合。而ART-SD的羰基峰在1 653、1 735 cm-1，表明ART與載體間可能形成氫鍵，生成了固體分散體，使吸收峰發(fā)生了紅移。

圖10 紅外吸收光譜圖譜

4 討論

固體分散體技術通過將藥物高度分散在適宜的載體材料中，并以無定型態(tài)、微晶態(tài)、分子分散態(tài)或膠體分散態(tài)存在，與胃腸液接觸后，藥物溶出速度加快，促進藥物吸收，提高生物利用度，以改善難溶性藥物口服吸收差的難題。根據(jù)載體性質和釋藥特點的不同，固體分散體又分為速釋型、緩控釋型和腸溶型固體分散體。本文選取親水性載體材料，利用其良好的潤濕性，使ART從速釋型ART-SD中快速被釋放，50 min內溶出度遠高于物理混合物和ART原料藥，有利于解決ART口服給藥吸收不完全的缺點。

其次，雙載體較單一載體可更大程度地增加藥物的溶出，大豆卵磷脂具有增溶性，PVP K30具有增加潤濕性、降低溶出介質的表面張力、抑制藥物結晶的特點[20,21]，在提高難溶性藥物的溶出方面廣泛選用PVP K30，而PEG 6000亦被用來與卵磷脂混合作為雙載體用于制備ART-SD，但不同復合載體對ART從ART-SD中溶出度影響目前并不明確，雙載體制備ART-SD工藝條件也尚未進行優(yōu)化。本文通過考察卵磷脂分別與PVP K30、PEG 6000組合成雙載體后對ART溶出度影響，發(fā)現(xiàn)卵磷脂-PVP K30更優(yōu)，并確定了二者的比例，在此基礎上，進行了雙載體溶劑法制備速釋型ART-SD工藝條件優(yōu)化，為ART新劑型開發(fā)奠定重要基礎。

5 結論

本實驗以ART溶出度為評價指標，通過單因素篩選雙載體種類、復合載體比例、反應時間、溶劑用量等，確定雙載體制備速釋型ART-SD的最優(yōu)處方為：50 mg ART，50 mg大豆卵磷脂，350 mg PVP K30(大豆卵磷脂和PVP K30比例1∶7)，按最優(yōu)工藝制得固體分散體中藥物含量為10.55%±0.04%，在30 min時達到溶出平衡，50 min內溶出度為87.21%±2.28%，顯著高于PM 3.45%±1.68%和ART原料藥0.05%±0.15%。DSC和IR分析表明ART與載體之間形成氫鍵且以新的無定型狀態(tài)存在，后續(xù)將深入研究ART-SD是否能夠改善ART作為難溶性藥物口服生物利用度低的不足，提高抗瘧活性，為臨床提供更為有效的抗瘧藥物。