孫麗芳，周 雪，汪 杰，李海池，葛發(fā)歡*

1廣東藥科大學中藥學院，廣州510006；2廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術研究中心，廣州511458；3中山大學藥學院，廣州510006

紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng)為菊科澤蘭屬多年生半灌木狀草本植物，廣泛分布于中國云南等西南地區(qū)。紫莖澤蘭屬于外來入侵物種，從上世紀50年代左右傳入我國云南，繁殖能力極強，70 年代成為草害，給西南地區(qū)農(nóng)、林、牧業(yè)造成難以遏制的生態(tài)災害[1]。為了有效控制紫莖澤蘭的蔓延，有學者進行過機械、化學、生物防治等嘗試，雖然三種方法的結合運用是有效的治理方式，但需要浪費大量的人力、物力。因此,充分研究開發(fā)與利用這一豐富的天然資源、變廢為寶成為解決紫莖澤蘭問題的有效途徑。

云南藥用植物名錄曾記載，紫莖澤蘭全草具活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒的功效，內(nèi)用可治感冒發(fā)熱、月經(jīng)不調(diào)、跌打腫痛，外用可治足癬、無名腫痛、外傷出血[2]。近年來，人們利用現(xiàn)代藥理的研究方法，對紫莖澤蘭的生物活性進行研究，表明紫莖澤蘭具有抗菌[3,12]，抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]以及殺蟲[7]等活性。根據(jù)紫莖澤蘭傳統(tǒng)的調(diào)經(jīng)活血、解熱消腫的功效可推測，紫莖澤蘭可能有一定的抗炎活性，然而目前僅見一篇對紫莖澤蘭精油化學反應產(chǎn)物的抗炎活性的報道[8]，紫莖澤蘭中固有的天然成分的抗炎活性還未見報道，研究紫莖澤蘭抗炎活性成分十分必要。本項目團隊曾采用新型提取分離技術對紫莖澤蘭提取、分離、純化等進行過研究，得到了超臨界CO2萃取、超臨界CO2萃取-分子蒸餾富集等提取部位及2個澤蘭酮單體[9,10](單體結構見圖1)，其中澤蘭酮類成分是超臨界CO2萃取部位、超臨界CO2萃取-分子蒸餾富集部位的主要成分。在此基礎上，本文對紫莖澤蘭的超臨界CO2萃取、分子蒸餾富集部位、甲醇提取部位的抗炎活性進行體外評價，尋找抗炎有效成分，為該植物的資源利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

TDZ5-WS型離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；多功能酶標儀(美國Bio-rad公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶重光實業(yè)有限公司)；DSX-280KB30型手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；細胞培養(yǎng)瓶、96孔板(美國Corning公司)；XS205 DuaL Range型百萬分之一分析天平、十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

紫莖澤蘭葉采自云南昆明市郊，由中山大學藥學院葛發(fā)歡教授鑒定為菊科植物紫莖澤蘭EupatoriumadenophorumSpreng．的葉，新鮮葉曬干。

euptox A(9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮，純度≥98%)、9-oxoageraphorone(9-羰基-10-Hβ-澤蘭酮，純度≥98%)；甲醇提取物(MSE，澤蘭酮含量>8%)、超臨界CO2提取物(SFE，澤蘭酮含量>60%)、超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物(MDE，澤蘭酮含量>80%)，均為葛發(fā)歡團隊實驗室自制；槲皮素對照品(純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；脂多糖(LPS，Sigma公司)；一氧化氮(NO)檢測試劑盒(碧云天生物公司)；小鼠TNF-αELISA試劑盒(索萊寶)；DMEM培養(yǎng)基、PBS溶液、血清、0.25%胰酶、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素-鏈霉素溶液等均來自美國Gibco公司；色譜級甲醇均來自美國Merck公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7來自中山大學藥學院。

2 實驗方法

2.1 紫莖澤蘭提取物的制備

按照文獻[9]，各個提取物的制備方法如下所述：

甲醇提?。壕芊Q取紫莖澤蘭干燥葉2.0 g，加入40 mL甲醇,室溫超聲提取30 min，提取液離心后，旋蒸，蒸干，計算收率。

超臨界提取法：將紫莖澤蘭葉粉碎，取300 g粉末，物料粒度80目，萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa、分離釜Ⅰ溫度40 ℃、分離釜Ⅰ壓力17 MPa，萃取2 h，即得。

超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物：取一定量預熱過的紫莖澤蘭超臨界萃取物加入進料口，保持進料口溫度為35 ℃(保證樣品流動性)蒸發(fā)溫度133.99 ℃，真空度23.76 Pa，刮膜轉(zhuǎn)速300 rpm，得到分子蒸餾二級產(chǎn)物。

2.2 MTT法檢測細胞增殖活力

采用MTT法檢測紫莖澤蘭各個提取物及單體對小鼠單核巨噬細胞增殖活力的影響，篩選有效且安全的質(zhì)量濃度。調(diào)整細胞濃度為6×104/mL接種至96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，加入不同濃度的藥液作為給藥組，另設空白組(只加培養(yǎng)液)和陰性對照組(含有細胞和培養(yǎng)液)，培養(yǎng)48 h后，避光加20 μL的MTT(5 mg/mL PBS溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結束后，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩10 min，使用酶標儀在490 nm處檢測吸光值。

2.3 Griess法檢測小鼠單核巨噬細胞NO釋放量

采用LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型評價紫莖澤蘭各提取物及單體抗炎活性。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，空白培養(yǎng)基清洗2遍，向其中加入適量的完全培養(yǎng)基，吹打均勻，于細胞計數(shù)板計數(shù)后，加入完全培養(yǎng)基后將細胞稀釋至濃度為5×105/mL，接種至96孔板，每孔100 μL，過夜培養(yǎng)至細胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，每孔加入經(jīng)培養(yǎng)基稀釋至終濃度的待測樣品，分為LPS組(陰性對照組)，LPS+給藥組，LPS終濃度均為1 μg/mL，空白組加入完全培養(yǎng)基，每個濃度設置3個復孔(0.2 mL/每孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在新的96孔板每孔加入50 μL培養(yǎng)液上清后，按炎癥因子試劑盒說明書操作，測定NO 的釋放量。用酶標儀測定吸光度值(波長540 nm),實驗數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 7 生物統(tǒng)計學軟件計算藥物對RAW細胞炎癥因子NO釋放抑制率IC50值。

2.4 ELISA法檢測小鼠單核巨噬細胞TNF-α釋放量

RAW264.7細胞接種密度為2×104/孔，其他操作與“2.3”相同，收集每孔細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作來測定各組培養(yǎng)孔內(nèi)細胞上清液中炎性因子TNF-α的表達水平。

2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以Mean ± SD表示，組間數(shù)據(jù)對比采用獨立樣本t檢驗，將數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism 7.0繪圖軟件制作成直方圖的形式表現(xiàn)實驗結果之間的差異。

3 結果與分析

3.1 紫莖澤蘭提取物澤蘭酮類成分含量

按照文獻[9,10]，為了便于直觀分析比較各提取物抗炎活性與澤蘭酮類成分的關系，本研究所提供實驗樣品的含量匯總如下，見表1。

3.2 細胞活力分析

與陰性對照組相比，三個提取物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，甲醇提取物(MSE)、超臨界CO2提取物(SFE)、超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物(MDE)細胞增殖活力均大于95%，見圖2，說明三個提取物的質(zhì)量濃度≤100 μg/mL的提取物藥液對RAW264.7細胞活性沒有顯著性差異；兩個單體摩爾濃度為300 μmol/L時，euptox A、9-oxoageraphorone的細胞增殖活力均大于90%，說明摩爾濃度≤300 μmol/L的單體藥液對RAW 264.7細胞活性沒有顯著性差異。綜上，三個提取部位在小于100 μg/mL的藥液濃度是安全濃度范圍，兩個單體在小于300 μmol/L的濃度范圍是安全濃度范圍。

圖2 紫莖澤蘭各成分對小鼠巨噬細胞增殖活力的影響

3.3 紫莖澤蘭三個提取物的抗炎活性

3.3.1 紫莖澤蘭提取物對炎癥因子TNF-α的影響

經(jīng)ELISA法檢測，與對照組相比，LPS組細胞上清液中TNF-α含量顯著增高(P<0.05)；20 μmol/L的槲皮素為陽性對照，TNF-α的釋放量為21 722.55 pg/mL。三個提取物的不同濃度的給藥組，與LPS共同處理24 h后，RAW264.7分泌TNF-α炎癥因子較LPS組均減少，且隨著各個提取物濃度的增加，炎癥因子TNF-α減少更加明顯，說明SFE、MDE、MSE對小鼠巨噬細胞分泌TNF-α均起到抑制作用，見圖3。

圖3 紫莖澤蘭提取物對RAW264.7細胞產(chǎn)生的TNF-α表達的影響

3.3.2 紫莖澤蘭提取物對炎癥因子NO的影響

本實驗利用LPS誘導RAW 264.7細胞，構建體外炎癥模型，采用格里斯試劑法(Griess)檢測細胞上清液中一氧化氮(NO)的分泌量。在確定不同提取物的無毒性劑量范圍后，研究了不同提取物對LPS誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞NO生成量的影響，當細胞不受外界刺激時，細胞基本不表達NO，在終濃度為1 μg/mL LPS刺激24小時后，巨噬細胞釋放出大量的NO。由圖4可知，LPS組的NO釋放量均顯著高于對照組(P<0.001)，表明造模成功。在測定中，以槲皮素為陽性對照(半抑制濃度IC50=14.23 μmol/L)，與LPS組相比，質(zhì)量濃度在5～100 μg/mL的三個提取部位的藥液濃度均可降低NO釋放量，且具有劑量依賴性。

由圖4A可知，與模型組相比，SFE藥液在質(zhì)量濃度為5、10、15、25、50、100 μg/mL對LPS誘導的RAW264.7細胞NO生成量顯著低于模型組(P< 0.05)，NO的釋放量隨著藥液濃度的增加而降低，IC50值為32.22 μg/mL。結果說明，SFE部位抗炎活性明顯，超臨界提取物的抗炎活性與提取物濃度呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關系。

由圖4B結果可知，不同濃度的MDE藥液對RAW 264.7細胞均有不同程度的NO抑制作用(P<0.01)，且當MDE藥液的質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時，NO抑制率大于60%，IC50值為31.59 μg/mL。說明MDE部位有較明顯的抗炎活性，MDE部位的抗炎活性隨藥液濃度的升高而升高。

由圖4C可知，與模型組相比，各濃度MSE藥液顯著降低NO釋放量(P< 0.05)。質(zhì)量濃度大于25 μg/mL的MSE藥液能顯著降低NO的釋放量(P<0.001)，且隨著藥液濃度的增加，NO的釋放量越低，IC50值為50.38 μg/mL。結果說明，甲醇提取物有一定的抗炎活性，與提取物濃度呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關系。

圖4 紫莖澤蘭提取物對RAW264.7細胞產(chǎn)生的NO表達的影響

綜合以上研究結果，SFE、MDE、MSE的IC50值分別為32.22、31.59、50.38 μg/mL，說明SFE、MDE的抗炎活性相似，并顯著高于好于MSE。根據(jù)課題組前期研究結果[9,10]可知，超臨界CO2萃取及其分子蒸餾富集部位中euptox A、9-oxoageraphorone為主要成分，SFE和MDE富含澤蘭酮類物質(zhì)，euptox A、9-oxoageraphorone這兩種澤蘭酮總量均在60%以上[9]，遠高于MSE中的澤蘭酮的含量，而SFE、MDE抗炎活性明顯高于MSE的，因此推測，紫莖澤蘭的抗炎活性可能與澤蘭酮類物質(zhì)有關。因此，進一步研究了澤蘭酮單體euptox A、9-oxoageraphorone的抗炎活性。

3.4 紫莖澤蘭單體euptox A、9-oxoageraphorone抗炎活性

3.4.1 Euptox A、9-oxoageraphorone對炎癥因子TNF-α的影響

由圖5可知，euptox A、9-oxoageraphorone的不同濃度的給藥組，與LPS共同處理24 h后，RAW264.7分泌TNF-α炎癥因子較LPS組均減少，且隨著各個提取物濃度的增加，炎癥因子TNF-α遞減，說明euptox A、9-oxoageraphorone對小鼠巨噬細胞分泌TNF-α均起到抑制作用。

圖5 化合物對LPS誘導的RAW264.7細胞的TNF-α生成量的影響

3.4.2 Euptox A、9-oxoageraphorone對炎癥因子NO的影響

按照上述提取物抗炎活性測定方法，對單體euptox A進行了抗炎活性研究，結果見圖6A。當摩爾濃度為25～300 μmol/L 時，euptox A藥液極顯著的降低NO的釋放量(P<0.001)。不同摩爾濃度的euptox A對RAW 264.7細胞NO的釋放均有抑制作用，且細胞中NO含量與提取物濃度有明顯的劑量依賴性，隨euptox A濃度的升高而降低。Euptox A的IC50值為69.98 μmol/L(16.23 μg/mL)，顯著低于三個提取物的IC50值，說明euptox A有顯著的抗炎活性，且其抗炎活性優(yōu)于各個提取物。

圖6 化合物對LPS誘導的RAW264.7細胞的NO生成量的影響

由圖6B結果可知，當摩爾濃度為50～300 μmol/L 時，9-oxoageraphorone藥液極顯著的降低NO的釋放量(P<0.001)。不同摩爾濃度的9-oxoageraphorone藥液對RAW 264.7細胞均有不同程度的NO抑制作用，9-oxoageraphorone藥液的抗炎活性在5～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，從100 μmol/L 開始進入了平臺期。9-Oxoageraphorone的IC50值為43.14 μmol/L(10.09 μg/mL)，結果顯示澤蘭酮單體9-oxoageraphorone具有顯著的抗炎活性，其抗炎活性高于euptox A和三個提取物。

表2 紫莖澤蘭各個樣品的IC50值匯總

從以上研究結果可以看出，euptox A、9-oxoageraphorone兩個單體化合物均有顯著的抗炎活性，其中9-oxoageraphorone抗炎活性更強，說明euptox A、9-oxoageraphorone是紫莖澤蘭中有效的抗炎成分之一。

4 小結與討論

基于體外細胞炎癥模型，本文首次對紫莖澤蘭超臨界CO2提取物、超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物、甲醇提取物三個提取部位以及euptox A、9-oxoageraphorone的抗炎活性進行研究。從體外抗炎效果來看，超臨界CO2提取物和超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物表現(xiàn)出明顯的抗炎活性；超臨界CO2提取物和超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物富含澤蘭酮類成分，推測紫莖澤蘭的抗炎活性與澤蘭酮類物質(zhì)有關。Euptox A、9-oxoageraphorone單體化合物具有顯著的抗炎活性，且兩個單體均好于各個提取物。結果證明澤蘭酮類物質(zhì)有良好的抗炎活性，是紫莖澤蘭抗炎的有效成分之一。

本研究僅探討了紫莖澤蘭超臨界CO2提取物和超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物以及主要的澤蘭酮單體化合物euptox A、9-oxoageraphorone的體外抗炎活性，紫莖澤蘭中可能還含有少量9-羰基-12-羥基-10，11-去氫澤蘭酮、9β-羥基澤蘭酮、9-羥基澤蘭酮乙酸酯等多種結構相似的澤蘭酮類化合物[11]，其他澤蘭酮成分的體內(nèi)外抗炎活性及抗炎機制值得深入系統(tǒng)研究。