蔡菲菲，王秀峰，周錢梅，陸奕宇，蘇式兵

上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院中醫(yī)復(fù)雜系統(tǒng)研究中心，上海 201203

乳腺癌(breast cancer)在中醫(yī)學(xué)范疇被稱為“乳巖”、“乳石癰”等，是女性中最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率不斷上升，發(fā)病年齡越來越小，嚴(yán)重威脅著女性的健康[1]。雖然乳腺癌在早期篩查、手術(shù)和放化療技術(shù)等方面有了顯著的進(jìn)展，但對(duì)于晚期乳腺癌的全身性轉(zhuǎn)移，臨床缺少安全有效的治療藥物，是目前臨床治療的難點(diǎn)，也是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。中藥及其活性成分被報(bào)道具有抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用[2]，成為乳腺癌轉(zhuǎn)移治療藥物的研究熱點(diǎn)之一。黃芩素(baicalein)是中藥黃芩的主要生物活性成分之一，在體內(nèi)外研究中均已被證明具有抗腫瘤、抗炎、抗心血管疾病和抗菌活性[3]。近年來，黃芩素因能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，或誘導(dǎo)低毒性癌細(xì)胞的凋亡和自噬性細(xì)胞死亡[4]，尤其因其能抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移而受到越來越多的關(guān)注[5,6]。乳腺癌組織中異常激活的RhoA和ROCK，引起下游MLC磷酸化增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。本研究旨在通過建立人乳腺癌異種移植瘤裸鼠模型，觀察黃芩素抑制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)作用，并探討黃芩素參與ROCK介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重組抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

4～6周齡的BALB/c裸小鼠，雌性，體質(zhì)量20±2 g，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 藥物

黃芩素(含量98%)產(chǎn)品編號(hào)：05-2001，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供，用二甲基亞砜(DMSO)稀釋為100 mmol/L，0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝。紫杉醇注射液，批號(hào)090603，30 mg/5 mL，購自?？谑兄扑帍S有限公司。

1.3 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；胎牛血清FBS(美國PAA公司)；胰蛋白酶(美國Amersco公司)；DMSO(美國Sigma公司)；SDS、Aprotinin、Tris-base(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PMSF、APS、TEMED、蛋白定量試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)；抗體GAPDH等(美國Cell Signaling Technology公司)；Transwell小室(美國Corning-Costar公司)；Y-27632(美國MedChemExpress公司)。

1.4 儀器

生物安全柜(HFsafe-500，香港力康發(fā)展有限公司)；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(3111，美國Thermo Forma公司)；倒置顯微鏡(100-120，日本Olympus公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Synergy2，美國BioTek公司)；離心機(jī)(ST16R，美國Thermo Forma公司)；Bio-Rad電泳儀及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(1658033，美國Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon 2500，上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 黃芩素安全性評(píng)價(jià)

將30只4～6周齡的SPF級(jí)BALB/c雌性裸小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、生理鹽水組、黃芩素組，每組10只。生理鹽水組、黃芩素組分別予0.2 mL生理鹽水和黃芩素組100 mg/kg腹腔注射給藥，每天一次，共給藥8周。每日稱量并記錄體重，8周后，摘眼球取血，頸脫位法處死，將血液離心分離血清和血細(xì)胞凍存于-80 ℃。檢測(cè)血清肝功指標(biāo)ALT、AST和腎功能指標(biāo)BUN、Cr以評(píng)價(jià)黃芩素的毒副作用。本研究根據(jù)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中規(guī)定的動(dòng)物護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.2 黃芩素對(duì)人乳腺癌異種移植瘤裸鼠的作用研究

20只SPF級(jí)BALB/c雌性裸小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、紫杉醇組及黃芩素組，每組5只。除正常組外，將細(xì)胞總數(shù)為5×106的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231注射到裸鼠右上肢腋下乳房脂肪墊中，觀察并記錄裸鼠體重變化和腫瘤生長情況。在造模后的第二天開始給藥。黃芩素組以50 mg/kg[5]，隔天一次給藥0.2 mL；紫杉醇組以10 mg/kg[8]，每三天一次給藥0.2 mL；正常組、模型組以等量的生理鹽水0.2 mL腹腔注射給藥，每天一次，共給藥8周。給藥8周的裸鼠稱體重后，摘眼球取血，頸脫位法處死。血液離心分離血清和血細(xì)胞凍存于-80 ℃。完整剝離腫瘤組織，稱取腫瘤組織重量，一部分放入福爾馬林組織固定液中，另一部分-80℃凍存。用1 mL注射器從裸鼠主支氣管注入適量福爾馬林固定液后摘下整個(gè)肺臟，放入福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片做H&E染色。

2.3 黃芩素抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

2.3.1 細(xì)胞分組及處理

用含10% FBS的1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，分為正常對(duì)照組，黃芩素組，抑制劑Y-27632組和黃芩素組與抑制劑聯(lián)用組。黃芩素組分別用100、50、25 μM的黃芩素進(jìn)行干預(yù)，抑制劑組用10 μM Y-27632干預(yù)，聯(lián)用組以100 μM黃芩素+10 μM Y-27632干預(yù)細(xì)胞。

2.3.2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移力

將各組MDA-MB-231細(xì)胞預(yù)先接種在24孔Transwell小室上室中，下室加入含10% FBS的1640培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，清洗并擦拭除去上室表面的非遷移細(xì)胞。將遷移的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下對(duì)每個(gè)腔室的至少三個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。遷移抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

2.3.3 免疫熒光染色觀察細(xì)胞骨架蛋白F-actin變化

各組MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)用藥處理24 h后，用4%多聚甲醛固定，室溫下在濕盒中孵育稀釋好的一抗及二抗，用PBS清洗，干燥后封片，即刻在激光共聚焦顯微鏡檢查下觀察。

2.3.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)

收集各組MDA-MB-231細(xì)胞并裂解，以BCA蛋白測(cè)定其蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在4 ℃下將膜與主要抗體一起孵育過夜，將GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，在室溫下用二抗孵育1 h。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像儀可視化目標(biāo)蛋白條帶

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0和Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩素(100 mg/kg)對(duì)裸鼠未產(chǎn)生明顯毒副作用

為了闡明黃芩素的安全性，我們檢測(cè)了100 mg/kg黃芩素在裸鼠體內(nèi)是否產(chǎn)生毒副作用。每周檢測(cè)各組裸鼠的體重變化，正常對(duì)照組和用藥組之間裸鼠體重沒有顯著的差異(見圖1)。此外，圖1中的血生化結(jié)果顯示，裸鼠肝功指標(biāo)ALT、AST和腎功能指標(biāo)BUN、Cr均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 黃芩素對(duì)裸鼠體重及肝腎功能的影響

3.2 黃芩素抑制乳腺癌異種移植瘤裸鼠腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移

為了觀察黃芩素對(duì)乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)作用，采用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株建立移植瘤裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。如圖2結(jié)果所示，用藥組裸鼠腫瘤的瘤體體積和重量明顯小于模型組，且差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中黃芩素組抑瘤效果弱于紫杉醇組。圖3中裸鼠肺轉(zhuǎn)移組織病理結(jié)果顯示，與正常組比較，其余各組均有癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而用藥后轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)和轉(zhuǎn)移灶明顯小于模型組，紫杉醇組肺轉(zhuǎn)移率為60%，黃芩素組肺轉(zhuǎn)移率為80%。該結(jié)果表明黃芩素具有明顯抑制乳腺癌原位腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移的作用。

圖3 黃芩素對(duì)移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用(HE，×100)

圖2 黃芩素對(duì)移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用

3.3 黃芩素和ROCK抑制劑Y-27632抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移

黃芩素在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抑制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的作用，我們進(jìn)一步在體外研究黃芩素抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制。通過體外遷移實(shí)驗(yàn)，我們分別用100 μM黃芩素、10 μM Y-27632(Rho下游激酶ROCK的特異性抑制劑)、100 μM黃芩素+10 μM Y-27632處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組相比，黃芩素和Y-27632(10 μM)均能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移力(P<0.001)。與單獨(dú)使用抑制劑相比，將Y-27632與黃芩素聯(lián)合應(yīng)用后抑制細(xì)胞遷移的作用更明顯(P<0.01)(見圖4)。

圖4 黃芩素和Y-27632對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移力的影響

3.4 黃芩素和ROCK抑制劑Y-27632抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)

通過體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芩素能夠抑制細(xì)胞遷移，我們進(jìn)一步利用細(xì)胞熒光化學(xué)染色方法，觀察用藥后MDA-MB-231細(xì)胞骨架蛋白F-actin的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未用藥處理的細(xì)胞內(nèi)有明顯的蛋白質(zhì)纖維束形成，而經(jīng)黃芩素和Y-27632處理24 h后的細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)被抑制，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯(見圖5)。

圖5 黃芩素和Y-27632對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移力的影響

3.5 黃芩素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

通過以上的實(shí)驗(yàn)我們知道黃芩素具有抑制人乳腺癌MDA-MB-231體外遷移的作用，并且該作用與影響細(xì)胞骨架蛋白的重組有關(guān)。為進(jìn)一步明確黃芩素在這一過程中影響了哪些蛋白參與調(diào)控骨架蛋白重組，我們進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6所示，100 μM黃芩素能夠顯著抑制ROCK1(P<0.05)，Rac1(P<0.01)和RhoA(P<0.05)的表達(dá)。Rho和ROCK的下游調(diào)控蛋白是肌球蛋白輕鏈蛋白MLC。我們發(fā)現(xiàn)100 μM黃芩素和10 μM 的Y-27632均能夠明顯抑制MLC的磷酸化(P<0.05)，兩藥合用效果顯著(P<0.01)。這說明黃芩素抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移可能與抑制RhoA-ROCK-MLC信號(hào)通路相關(guān)。

圖6 黃芩素和Y-27632對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

4 討論

黃芩素作為黃芩根的有效提取物，在多種癌癥中均顯示出了其抗癌能力[9,10]。有研究表明，黃芩素能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和自噬[11]，通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[12]。然而，黃芩素抗腫瘤的作用尚未在臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，其抑制乳腺癌細(xì)胞遷移的具體機(jī)制也尚未解明。本研究在人乳腺癌異種移植瘤裸鼠模型上，觀察到黃芩素能夠抑制乳腺癌原位腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，抑制效果不及紫杉醇，但是對(duì)裸鼠的體重和肝腎功能均沒有顯著影響，表明黃芩素應(yīng)用于乳腺癌防治可能是比較安全的，這與既往黃芩素抑制乳腺癌裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型的體內(nèi)研究結(jié)果一致[13]。

腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因之一，而細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)受到Rho家族基因的調(diào)控。它們通過調(diào)控細(xì)胞的骨架重組，細(xì)胞的黏附和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)等參與癌轉(zhuǎn)移[14]。單個(gè)或集體腫瘤細(xì)胞遷移是這一復(fù)雜過程中的關(guān)鍵步驟，涉及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑以及與相鄰細(xì)胞和與基礎(chǔ)結(jié)締組織細(xì)胞粘連的動(dòng)態(tài)重組，信號(hào)蛋白以及細(xì)胞骨架相關(guān)的支架成分，以協(xié)調(diào)的方式介導(dǎo)細(xì)胞與ECM的粘附[15]。在本研究中觀察到黃芩素具有抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移的作用，與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的是，有研究報(bào)道，黃芩素可能通過抑制MMP-9蛋白表達(dá)，抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移[16]。

Rho家族蛋白對(duì)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)起調(diào)控作用，RhoA是Ras超家族中小分子量的G蛋白成員之一，主要是通過影響細(xì)胞骨架參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。Rac1是Rho家族Rac亞家族的成員，能夠調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞骨架重組[18]，是許多細(xì)胞過程的多效性調(diào)節(jié)劑，包括細(xì)胞周期，細(xì)胞間粘附，以及通過肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性[19]。Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)是一種屬于AGC(PKA/PKG/PKC)絲氨酸-蘇氨酸激酶家族的激酶[20]，是RhoA的下游靶效應(yīng)分子，它主要通過作用于細(xì)胞骨架而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀和運(yùn)動(dòng)[21]。已發(fā)現(xiàn)大鼠ROCK是Rho的第一個(gè)效應(yīng)物，它們通過使下游肌球蛋白輕鏈MLC的磷酸化來誘導(dǎo)應(yīng)激纖維的形成和粘著斑[22]，目前已經(jīng)鑒定出兩個(gè)小鼠ROCK同工型ROCK1和ROCK2。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩素同ROCK的特異性抑制劑Y-27632單用或聯(lián)合應(yīng)用能夠改變細(xì)胞的骨架重組，抑制細(xì)胞遷移，同時(shí)抑制ROCK1、Rac1和RhoA的蛋白表達(dá)水平，并且抑制MLC的磷酸化。這表明黃芩素抑制癌細(xì)胞遷移可能與Rho-ROCK-MLC通路相關(guān)。

綜上，黃芩素能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231異種移植瘤裸鼠的腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，且無明顯肝腎毒性。而且，黃芩素可能是通過調(diào)節(jié)Rho-ROCK-MLC通路，影響細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。