李翠萍，陳乃源，李昕宇，盧國(guó)棟

1廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4廣西高校高發(fā)疾病預(yù)防與控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程起著重要作用，在許多腫瘤細(xì)胞中存在過度激活的現(xiàn)象，并被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生[1,2]。而抑制該信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，也能恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[3]。因此，開發(fā)小分子PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)之一[4]。去氫樅酸(DHA)是一種重要的三環(huán)二萜類天然樹脂酸，也是傳統(tǒng)中藥松香的成分之一，主要由松香經(jīng)歧化反應(yīng)后分離獲得。其性質(zhì)穩(wěn)定且具有與甾類分子類似的結(jié)構(gòu)，目前已被廣泛用于熒光試劑和藥物中間體的合成與開發(fā)。去氫樅酸及許多它的衍生物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[5-7]。近期報(bào)道顯示，去氫樅酸的1H苯并[d]咪唑類衍生物對(duì)PI3Kα有抑制效果，能夠下調(diào)磷酸化AKT的表達(dá)[8]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，部分B環(huán)改性的去氫樅酸衍生物能夠降低磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表達(dá)水平，同樣也能降低其下游效應(yīng)器S6和4EBP1的磷酸化水平[9]。雖然不同去氫樅酸衍生物對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表現(xiàn)出了一定的抑制作用，但去氫樅酸本身是否具有相應(yīng)的抑制能力，目前尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

大多數(shù)化合物通過與蛋白分子的結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)作用，其結(jié)合模式和結(jié)合能力可通過蛋白晶體解析和蛋白熒光猝滅等手段來驗(yàn)證，但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，成本較高。分子對(duì)接技術(shù)是一種利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行理論計(jì)算預(yù)測(cè)化合物與受體蛋白結(jié)合情況的手段，可根據(jù)對(duì)接結(jié)合能的大小判斷化合物與蛋白的結(jié)合能力，篩選出潛在的蛋白調(diào)節(jié)劑；也可通過所得的對(duì)接構(gòu)像和其他的對(duì)接評(píng)分進(jìn)行初步的機(jī)理研究[10-12]。此外，了解化合物在人體的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)特性可以判斷其是否可作為臨床治療的候選化合物。為了降低研究成本，計(jì)算機(jī)輔助程序已逐漸被用于類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)的初步研究[13,14]。

因此，本研究利用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)去氫樅酸與該通路關(guān)鍵蛋白的結(jié)合能力和結(jié)合方式，并用蛋白免疫印跡法驗(yàn)證去氫樅酸的實(shí)際抑制情況，進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行類藥性與藥代動(dòng)力學(xué)的模擬，以初步了解去氫樅酸作為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑的潛力，為進(jìn)一步開發(fā)去氫樅酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分子對(duì)接

1.1.1 蛋白數(shù)據(jù)獲取

本研究選取人癌細(xì)胞中過度激活的Ⅰ類PI3K催化亞基p110的四個(gè)亞型α、β、γ、δ[15]，AKT的3種亞型AKT1、AKT2、AKT3、以及mTOR[16]進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)主要從RCSB Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中獲取，蛋白文件ID分別為：PI3Kα(4ZOP)、PI3Kβ(4J6I)、PI3Kγ(3L54)、PI3Kδ(4GB9)、AKT1(3MVH)、AKT2(3D0E)和mTOR(4JT6)，配體均為ATP-競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。AKT3結(jié)構(gòu)的PDB文件通過Phyre2網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測(cè)得到[17]。

1.1.2 配體文件的準(zhǔn)備

蛋白文件中的配體分子經(jīng)PyMOL Molecular Graphics System(Version 2.0 Schr?dinger,LLC)提取后保留為“.pdb”格式備用。去氫樅酸(圖1)和前期研究中的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制分子(含吡啶-3-甲基胺結(jié)構(gòu)的去氫樅酸衍生物，DBDA)[9]由ChemOffice 2019繪制成3D格式，經(jīng)MM-2能量?jī)?yōu)化后保存為“.pdb”格式備用。所有“.pdb”格式文件的分子，經(jīng)AutoDock 4.2.6軟件(AutoDock)自動(dòng)選擇可扭轉(zhuǎn)鍵后保存為PDBQT文件備用。

圖1 去氫樅酸的結(jié)構(gòu)

1.1.3 蛋白文件的準(zhǔn)備

利用PyMOL Molecular Graphics System刪除蛋白文件中的配體、水和金屬等小分子，刪除相似性極高的重復(fù)蛋白鏈，以保留A鏈為主。利用AutoDock對(duì)蛋白進(jìn)行“加氫”、自動(dòng)計(jì)算“Gasteiger charges”、設(shè)置原子類型為“Assign AD4 type”后保存為PDBQT文件備用。

1.1.4 對(duì)接的執(zhí)行

“GridBox”的“grid map”設(shè)置為60×60×60以涵蓋ATP位點(diǎn)(中心分別為：PI3Kα，x=-2.4、y=12.3、z=-17.3；PI3Kβ，x=19.0、y=60.0、z=22.0；PI3Kγ，x=22.0、y=15.0、z=22.0；PI3Kδ，x=17.0、y=-5.0、z=21.0；ATK1，x=19.0、y=-3.0、z=28.0；AKT2，x=23.0、y=-18.0、z=7.0；AKT3，x=3.0、y=15.0、z=-42.0；mTOR，x=52.0、y=1.0、z=-47.0)。對(duì)接程序使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行，選取結(jié)合能最低的構(gòu)像作為預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。當(dāng)各蛋白原配體重新對(duì)接的構(gòu)像均方根偏差(root mean square deviation，RMSD或refRMS)差小于2?時(shí)，則認(rèn)為此對(duì)接方法有較好的準(zhǔn)確性[18]。

1.1.5 對(duì)接結(jié)果分析

配體-蛋白相互作用的3D構(gòu)像使用PyMOL制作，配體-蛋白相互作用的2D構(gòu)像使用LigPlot+2.1制作。去氫樅酸與原配體重疊的相互作用殘基用紅圈指示。相互作用殘基是否參與配體-蛋白的結(jié)合通過可接觸表面積(accessible surface area，ASA)的損失(ΔASA)來衡量，配體與殘基的相互作用越緊密ΔASA越大，一般ΔASA大于10?2可認(rèn)為該相互作用參與了配體-蛋白的結(jié)合[19]。各殘基的ASA通過Accessible Surface Area and Accessibility Calculation for Protein(ver.1.2)(http://cib.cf.ocha.ac.jp/bitool/ASA/)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算。各殘基的ΔASA=ASA對(duì)接前﹣ASA對(duì)接后。

1.2 蛋白免疫印跡測(cè)試

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCC9細(xì)胞，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入含有不同濃度藥物(0、13和26 μM的去氫樅酸)的培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)后，用冷PBS洗，進(jìn)一步用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集，加入200 μL裂解液(196 μL裂解液加2 μL PMSF和2 μL蛋白磷酸酶抑制劑混合物)(Solarbio)裂解，置于冰上研碎至勻漿后，4 ℃放置30 min，用BCA試劑盒檢測(cè)(Beyotime)蛋白濃度，用SDS-PAGE凝膠電泳(Beyotime)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。次日洗膜后，在室溫下用相應(yīng)的二抗孵育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影(Merck，德國(guó))。使用全能成像系統(tǒng)顯示蛋白條帶(ChemiDoc MP，Bio-Rad，USA)。一抗為：PI3K p110、PI3K p85、p-AKT、AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6，GAPDH作為內(nèi)參(Cell Signaling Technology，Boston，USA)。

1.3 類藥性與藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)

利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器“pkCSM-pharmacokinetics”(http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)對(duì)去氫樅酸的類藥性(利賓斯基五法則)和藥代動(dòng)力學(xué)(吸收、分布、代謝、排泄和毒性)進(jìn)行預(yù)測(cè)[19]。該預(yù)測(cè)方法是將已知藥代動(dòng)力學(xué)特性的分子進(jìn)行圖形建模，轉(zhuǎn)化成原子間距離參數(shù)的識(shí)別標(biāo)志，再用這些識(shí)別標(biāo)志和分子的特性建立藥代動(dòng)力學(xué)的回歸與分類模型。待測(cè)分子也轉(zhuǎn)換成識(shí)別標(biāo)志后代入模型并進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)接結(jié)合能

對(duì)接結(jié)果顯示(表1)，原配體重新對(duì)接的RMSD值均小于2 ?，最大值為0.48 ?，說明對(duì)接程序的預(yù)測(cè)結(jié)果能夠很好的重復(fù)原配體在蛋白中的構(gòu)像，對(duì)接方法較為可靠。DHA與通路蛋白的最低對(duì)接結(jié)合能均為負(fù)值，最大值為-6.16 kcal/mol，說明DHA可能對(duì)這些蛋白的ATP位點(diǎn)均有一定的結(jié)合能力。雖然最低對(duì)接結(jié)合能均高于作為抑制劑的原配體，但與對(duì)該通路有抑制作用的DBDA接近。這預(yù)示著去氫樅酸可能對(duì)該通路也可以表現(xiàn)出抑制能力。

表1 PDB文件信息和最低對(duì)接結(jié)合能

2.2 去氫樅酸與各PI3K蛋白的對(duì)接結(jié)果

對(duì)PI3Kα的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖2)，去氫樅酸在PI3Kα的ATP結(jié)合位點(diǎn)共與12個(gè)殘基發(fā)生非鍵相互作用，其中9個(gè)殘基Val851、Trp780、Met922、Met772、Ile932、Ile848、Ser854、Gln859和Arg770對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Trp780的ΔASA(38.99 ?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表2)。有10個(gè)殘基與PI3Kα原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kα的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

圖2 去氫樅酸與PI3Kα對(duì)接的構(gòu)像

對(duì)PI3Kβ的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖3)，去氫樅酸在PI3Kβ的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基2個(gè)(Ala885和Lys890)、非鍵相互作用殘基11個(gè)。有9個(gè)殘基Val882、Trp812、Ala885H、Met953、Ile963、Ile831、Lys890、Ile879和Asp964對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Ile963的ΔASA (30.642 ?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表2)。此外，有10個(gè)殘基與PI3Kβ原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kβ的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

圖3 去氫樅酸與PI3Kβ對(duì)接的構(gòu)像

對(duì)PI3Kγ的分子對(duì)接預(yù)測(cè)顯示(圖4)，去氫樅酸在PI3Kγ的ATP結(jié)合位點(diǎn)共與12個(gè)殘基發(fā)生相互作用，其中與氫鍵相互作用殘基1個(gè)(Lys890)、非鍵相互作用殘基11個(gè)。有8個(gè)殘基Met804、Asp964、Met953、Ile963、Ile831、Ser806、Ile879和Lys890對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Met804的ΔASA(49.215 ?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表2)。有9個(gè)殘基與PI3Kγ原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kγ的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

圖4 去氫樅酸與PI3Kγ對(duì)接的構(gòu)像

對(duì)PI3Kδ的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖5)，去氫樅酸在PI3Kδ的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基1個(gè)(Lys890)、非鍵相互作用殘基12個(gè)。有7個(gè)殘基Met953、Lys890、Ile963、Met804、Ile879、Ile831和Ser806對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Lys890的ΔASA(43.805 ?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表2)。有11個(gè)殘基與PI3Kδ原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對(duì)PI3Kδ的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

圖5 去氫樅酸與PI3Kδ對(duì)接的構(gòu)像

表2 去氫樅酸與PI3K相互作用殘基信息

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.3 去氫樅酸與各AKT蛋白的對(duì)接結(jié)果

對(duì)AKT1的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖6)，去氫樅酸在AKT1的ATP結(jié)合位點(diǎn)與15個(gè)殘基發(fā)生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基2個(gè)(Thr211和Ala230)、非鍵相互作用殘基13個(gè)。有10個(gè)殘基Glu234、Asp292、Val164、Leu156、Arg4 (B)、Met281、Met227、Gly157、Ala177和Thr291對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10?2)，殘基Val164的ΔASA (40.176?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表3)。有12個(gè)殘基與AKT1原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對(duì)AKT1的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

圖6 去氫樅酸與AKT1對(duì)接的構(gòu)像

對(duì)AKT2的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖7)，去氫樅酸在AKT2的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生非鍵相互作用，其中8個(gè)殘基Lys181、Asp293、Val166、Glu236、Met229、Gly159、Thr292和Met282對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10?2)，殘基Val166的ΔASA (30.756?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表3)。有11個(gè)殘基與AKT2原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對(duì)AKT2的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著較為相似的結(jié)合方式。

圖7 去氫樅酸與AKT2對(duì)接的構(gòu)像

對(duì)AKT3的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖8)，去氫樅酸在AKT3的ATP結(jié)合位點(diǎn)與14個(gè)殘基發(fā)生非鍵相互作用，其中9個(gè)殘基Leu154、Val228、Val162、Met278、Gly155、Met225、Asp289、Lys177和Gly157對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10?2)，殘基Met278的ΔASA(41.586?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表3)。近半數(shù)的殘基與AKT1原配體的相互作用殘基重疊，說明去氫樅酸與AKT1配體在一定程度上對(duì)AKT3的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著相似的結(jié)合方式。

圖8 去氫樅酸與AKT3對(duì)接的構(gòu)像

表3 去氫樅酸與AKT相互作用殘基信息

2.4 去氫樅酸與mTOR蛋白的對(duì)接結(jié)果

對(duì)mTOR的分子對(duì)接結(jié)果顯示(圖9)，去氫樅酸在mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)與13個(gè)殘基發(fā)生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基1個(gè)(Val2240)、非鍵相互作用殘基12個(gè)。有9個(gè)殘基Trp2239、Ile2356、Ile2237、Met2345、Leu2185、Cys2243、Thr2245、Ala2248和Asp2244對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Trp2239的ΔASA(50.969 ?2)最大，可視為關(guān)鍵殘基(表4)。近半數(shù)的殘基與mTOR原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸與原配體可能在一定程度上對(duì)mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)有著相似的結(jié)合方式。

圖9 去氫樅酸與mTOR對(duì)接的構(gòu)像

表4 去氫樅酸與mTOR相互作用殘基信息

2.5 蛋白免疫印跡結(jié)果

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖10)，在去氫樅酸的作用下，SCC9的PI3K催化亞基p110的表達(dá)略有下調(diào)，調(diào)控亞基p85的表達(dá)明顯下調(diào)；PI3K下游蛋白AKT和mTOR的磷酸化明顯被抑制，但其總蛋白的表達(dá)基本不受影響；通路下游的效應(yīng)蛋白4EBP1的磷酸化略受抑制，S6的磷酸化明顯減少。這說明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路受到去氫樅酸的抑制。

圖10 去氫樅酸對(duì)蛋白表達(dá)的影響

2.6 類藥性與藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

類藥性預(yù)測(cè)結(jié)果經(jīng)“五倍率法則(Lipinski rule of five)”比較(表5)：去氫樅酸的分子量、油水分配系數(shù)(LogP)、可旋轉(zhuǎn)鍵(rotatable bonds)、氫鍵受體(acceptors)、氫鍵供體(donors)和總極化表面積(surface area)均在可接受值域內(nèi)。

表5 去氫樅酸類藥性預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)

藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表6)：去氫樅酸有較好的脂溶性和口服作用，容易通過腸道吸收，且不作為P-糖蛋白的底物；較易分布于血液，易穿透血腦屏障、穿透中樞神經(jīng)；對(duì)機(jī)體的代謝能力沒有影響；可以被正常排泄；不致突變，毒性較小?？偟膩碚f去氫樅酸通過了大多數(shù)的預(yù)測(cè)，成為安全藥物的可能性較大，可考慮作為治療使用的候選化合物[19]。

表6 去氫樅酸藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)

續(xù)表6(Continued Tab.6)

3 討論

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程起著重要作用，也是癌癥治療的靶點(diǎn)之一。PI3K主要由催化亞基p110和調(diào)控亞基p85構(gòu)成，經(jīng)磷酸化激活后，可將其底物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3能夠與AKT結(jié)合后通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)促使AKT磷酸化。經(jīng)磷酸化激活的AKT能夠直接或間接的使mTOR磷酸化，從而進(jìn)一步促進(jìn)下游效應(yīng)蛋白4EBP1和S6的磷酸化以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)生化活動(dòng)[20,21]。

本研究基于近年來去氫樅酸抗癌衍生物不斷被開發(fā)，部分衍生物被報(bào)道對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的部分關(guān)鍵蛋白有抑制作用[8,9,22]。為了研究作為原料的去氫樅酸對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響，為去氫樅酸抗癌衍生物的開發(fā)提供依據(jù)。利用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)了去氫樅酸對(duì)通路關(guān)鍵蛋白PI3K，AKT和mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力和結(jié)合方式，利用蛋白免疫印跡法檢驗(yàn)去氫樅酸對(duì)通路的抑制效果，通過初步的類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)去氫樅酸成為口服藥物的潛力。

分子對(duì)接結(jié)果表明，去氫樅酸對(duì)各關(guān)鍵蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)均有一定的結(jié)合能力，與AKT3的結(jié)合最弱，最低結(jié)合能為-6.16 kcal/mol，與AKT1結(jié)合最強(qiáng)，最低結(jié)合能為-8.04 kcal/mol。去氫樅酸對(duì)通路蛋白的結(jié)合能力弱于作為高效抑制劑的原配體，與我們已合成得到的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制分子DBDA相近。在ATP結(jié)合位點(diǎn)中，去氫樅酸與蛋白的相互作用殘基多為含疏水性殘基。除了PI3Kδ的Lys890，其他對(duì)配體-蛋白結(jié)合起最重要作用的關(guān)鍵殘基也均為疏水性殘基。說明去氫樅酸可能通過與ATP結(jié)合位點(diǎn)的腺嘌呤區(qū)結(jié)合從而產(chǎn)生抑制作用[23]。各蛋白與去氫樅酸的相互作用殘基跟原配體的有著大量的重疊，這表明去氫樅酸可能是以和原配體相近的方式與ATP展開競(jìng)爭(zhēng)以抑制蛋白作用。此外，沒有氫鍵存在的構(gòu)像，如去氫樅酸與PI3Kα、AKT2和AKT3，它們的結(jié)合能均高于其他存在氫鍵的構(gòu)像，這表明氫鍵對(duì)去氫樅酸與蛋白的穩(wěn)定結(jié)合發(fā)揮著重要作用。在去氫樅酸結(jié)合的構(gòu)像中，氫鍵全部在羧基位置產(chǎn)生。但是，異丙基和苯環(huán)附近存在多個(gè)在原配體中為氫鍵相互作用的重疊殘基。這一特征提示，在設(shè)計(jì)新的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑時(shí)，可加強(qiáng)羧基位置的親水能力，并在異丙基和苯環(huán)位置引入親水基團(tuán)，可能可以提高新化合物與蛋白的結(jié)合能力。

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，SCC9細(xì)胞經(jīng)去氫樅酸處理后，PI3K調(diào)控亞基p85的表達(dá)明顯降低。p85含量的減少可能使PI3K的生成受阻，并成為減少PI3K下游蛋白AKT磷酸化表達(dá)的因素之一。AKT和mTOR的總蛋白在不同濃度的去氫樅酸作用下與空白組相比沒有明顯的變化，但其磷酸化蛋白表達(dá)均明顯減少，說明AKT和mTOR的磷酸化進(jìn)程受到抑制。處于mTOR下游的4EBP1的磷酸化表達(dá)下降較少，可能是因?yàn)?EBP1還可經(jīng)MEK/Erk信號(hào)通路激活的原因[24]。而受mTOR調(diào)控的另一效應(yīng)蛋白S6K1下游的S6磷酸化表達(dá)明顯減少，可能是因?yàn)閙TOR的磷酸化受阻，導(dǎo)致S6K1激活減少，從而減少了S6的磷酸化反應(yīng)?？偟膩碚f在SCC9細(xì)胞內(nèi)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)受到了去氫樅酸的抑制，這與分子對(duì)接中預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)中，去氫樅酸的五倍率法則(Lipinski rule of five)分析顯示，其分子量、LogP、旋轉(zhuǎn)鍵、氫鍵受體、氫鍵供體的值均在該經(jīng)驗(yàn)性規(guī)則要求的范圍內(nèi)[25]。藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)對(duì)去氫樅酸在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等性能進(jìn)行模擬，去氫樅酸通過了大部分的測(cè)試，說明它可能可以較好的在體內(nèi)發(fā)揮藥物作用[19]。

總之，本研究通過分子對(duì)接預(yù)測(cè)、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、類藥性檢驗(yàn)和藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)去氫樅酸本身可能成為一種候選的治療藥劑，用于抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，以達(dá)到緩解腫瘤細(xì)胞耐藥和抗腫瘤的目的。也可以進(jìn)一步對(duì)去氫樅酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以開發(fā)出更有效的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑。