林秋伶 劉穎春 溫秋萍 周子寒 蔣燕霽 梁秀妹 龔文鋒 馬良 劉書言 余紅平

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2018年中國肝癌新發(fā)病例約41萬例，位居惡性腫瘤發(fā)病譜第5位；肝癌相關(guān)死亡人數(shù)約39.1萬例，位居惡性腫瘤死亡譜第2位［1］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌最主要的病理分型，占我國所有肝癌患者的90%［2］。近年來盡管肝癌的治療水平有了很大提高，但5年生存率仍不理想［3?4］。據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計，HCC患者的5年總生存率僅為12.1%［5］。導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的危險因素除了臨床分期、微血管侵犯、癌栓、甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）等因素外，個體的遺傳變異也可能影響HCC患者的預(yù)后［6］。因此，探索遺傳變異對HCC預(yù)后的影響，對患者的個體化治療和預(yù)后改善具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類非編碼小RNA，通過與信使RNA非翻譯區(qū)（3'?UTR）中的靶結(jié)合位點結(jié)合從而調(diào)控基因的表達［7］。位于miRNA結(jié)合位點上的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）可通過影響miRNA對靶基因的調(diào)控作用，改變靶基因轉(zhuǎn)錄水平或功能，從而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展［8］。研究證實，位于功能基因的miRNA結(jié)合位點SNP在癌癥發(fā)病風險和預(yù)后中起著重要作用［9?10］。YU等［11］研究發(fā)現(xiàn)FAM13A基因SNP rs9224（G＞A）與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)，A等位基因可能通過影響FAM13A基因和miRNA?22?5p的結(jié)合能力而增加肺鱗癌的死亡風險。ZHANG等［12］報道攜帶MDM4 rs4245739（A＞C）AC/CC基因型的口咽癌患者較攜帶AA基因型患者的總生存率和無病生存率顯著提高。ZHOU等［13］發(fā)現(xiàn)GOLGA7 rs11337（G＞T）可能與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有關(guān)，攜帶GT基因型患者的死亡風險高于攜帶GG基因型患者（HR=1.25，95%CI：1.04～1.50）。

DNA損傷可由各種內(nèi)源性和外源性刺激引起［14］，通過損傷修復(fù)反應(yīng)維持基因組完整性［15］。同源重組是DNA修復(fù)主要途徑之一，在DNA復(fù)制和DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)中起重要作用［16］。BRCA1 DNA修復(fù)相關(guān)基因（BRCA1 DNA repair associated，BRCA1）位于17q21.31號染色體上，在同源重組過程中起關(guān)鍵作用［17?18］。BRCA1表達水平的下調(diào)，降低了DNA修復(fù)能力，可增加癌細胞對包括化療和放療在內(nèi)的DNA損傷因子的敏感性［19］。已有研究表明BRCA1高表達與多種腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，包括卵巢癌、非小細胞肺癌和胃癌等［20?22］。DNA修復(fù)相關(guān)基因的遺傳變異，不僅影響癌癥發(fā)病風險，還影響患者的治療反應(yīng)，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和生存時間的差異［23］。本研究主要探討B(tài)RCA1 miRNA結(jié)合位點多態(tài)性與HCC患者術(shù)后總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究基于本課題組肝癌分子流行病學遺傳變異數(shù)據(jù)庫中接受根治術(shù)治療的411例HCC患者為研究對象，來源于2004年6月至2013年12月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院首次確診且接受根治性手術(shù)切除的HCC患者，均經(jīng)術(shù)后病理診斷或結(jié)合影像學及AFP等指標診斷為HCC。排除遠處轉(zhuǎn)移患者；合并嚴重心臟、肺臟、腎臟以及腦血管疾病患者；拒絕隨訪或無完整的臨床資料患者;術(shù)前曾接受放射治療和/或化療患者。本研究通過廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批，且經(jīng)研究對象知情同意。

1.2 資料收集與隨訪

通過電話進行隨訪。查閱病歷收集患者性別、年齡、飲酒史、吸煙史以及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染情況、BCLC分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否合并肝硬化、有無癌栓等資料。患者出院后2年內(nèi)每3個月電話隨訪1次，之后每6個月隨訪1次，隨訪截至2020年2月24日。以O(shè)S作為終點指標，OS為手術(shù)之日至患者死亡或末次隨訪的時間。失訪或末次隨訪仍未死亡的病例作為截尾事件。

1.3 SNPs的選擇和基因分型

1.3.1 BRCA1候選SNPs的選擇 基于SNP功能預(yù)測網(wǎng)站（http：//snpinfo.niehs.nih）篩選位于 BRCA1 miRNA結(jié)合位點上的SNPs。選擇標準：⑴位于miRNA結(jié)合位點上；⑵在中國北京漢族人群中最小等位基因頻率＞0.05。最終篩選到SNPs rs8176318和rs12516，這2個SNPs均位于miRNA結(jié)合位點且完全連鎖（r2=1）。本研究選擇BRCA1的rs8176318（C＞A）進行研究。

1.3.2 基因型檢測和質(zhì)量控制 采用苯酚?氯仿法從血液中提取DNA。SNP rs8176318（C＞A）使用Agena Mass ARRAY分型系統(tǒng)（Agena;San Diego，California）進行基因分型檢測。BRCA1 rs8176318位點PCR引物設(shè)計：上游序列為5'?ACGTTGGATGTCCTTCCATT?GAAGGGTCTG?3'，下游序列為5'?ACGTTGGATGTG?GCCTCAAGAGAATAGCTG?3'?；蚍中统晒β蕿?3.2%；隨機抽取10%樣品進行復(fù)檢，復(fù)檢一致率為100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

以乘積極限法（Kaplan?Meier）進行單因素分析，log?rank法比較攜帶不同基因型患者術(shù)后OS的差異，并使用GraphPad Prism 7.0軟件（GraphPad Software Inc，San Diego，CA，USA）繪制生存曲線。采用 SPSS 20.0軟件進行單因素和多因素Cox比例風險模型分析，計算風險比（hazard rate，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。表達數(shù)量性狀基因座分析（expressionquantitativetraitloci，eQTL）數(shù)據(jù)來源于GTEx數(shù)據(jù)庫（GTEx，V7，http：//www.gtexportal.org/home/）。所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究人群基本特征

本研究剔除基因分型失敗的28例和OS＜30 d的20例HCC患者，最終納入363例HCC患者進行生存分析，隨訪截止時，截尾數(shù)據(jù)97例（26.7%），其中失訪66例（18.2%）?；颊叩娜丝趯W和臨床病理特征分布（表1）：男性331例（91.18%），女性32例（8.82%）；吸煙者151例（41.6%），飲酒者134例（36.91%）；HBV感染者311例（85.67%）；BCLC分期A/B期201例（55.37%），BCLC分期C期162例（44.63%）；單個腫瘤285例（78.51%）；腫瘤直徑＞5 cm 230例（63.36%）；合并肝硬化201例（55.37%）；發(fā)生癌栓98例（23.00%）。Cox比例風險回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑＞5 cm（HR=1.883，95%CI：1.441～2.462，P＜0.001）和發(fā)生癌栓（HR=1.900，95%CI：1.443～2.503，P＜0.001）的患者死亡風險更高。

表1 363例HCC術(shù)后患者臨床病理特征與OS的關(guān)系Tab.1 Association between clinicopathological characteristics and OS in 363 HCC patients after hepatectomy

2.2 BRCA1 rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系

使用多因素Cox比例風險回歸模型分析在不同遺傳模型中rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性。在共顯性模型下，調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染情況、BCLC分期、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、肝硬化、癌栓等因素后，發(fā)現(xiàn)攜帶突變純合子AA基因型的HCC患者術(shù)后發(fā)生死亡的風險降低了30.3%（HR=0.697，95%CI：0.493～0.984，P=0.040）；在隱性模型（AAvsCC/AC）下，攜帶AA基因型的患者較CC/AC基因型患者術(shù)后發(fā)生死亡的風險降低了32.5%（HR=0.675，95%CI：0.494～0.922，P=0.014），見表2。Kaplan?Meier分析結(jié)果顯示，攜帶AA基因型的HCC患者較攜帶AC/CC基因型患者術(shù)后中位OS更長（46.1個月vs33.8個月，P=0.049），見圖1。

表2 BRCA1 rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系Tab.2 Association between BRCA1 rs8176318 and OS in HCC patients after hepatectomy

圖1 rs8176318 HCC位點不同基因型 術(shù)后患者的生存曲線Fig.1 Survival curves for HCC patients after hepatectomy by rs8176318 genotypes

2.3 分層分析rs8176318對HCC患者術(shù)后OS的影響

在年齡、腫瘤大小、癌栓和肝硬化分層下，rs8176318與HCC患者術(shù)后OS無統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。而在男性人群中，攜帶rs8176318位點AA基因型的患者較CC/CA基因型患者術(shù)后死亡風險顯著降低（HR=0.616，95%CI：0.443～0.856，P=0.004）；在飲酒人群中，攜帶AA基因型較攜帶CC/CA基因型患者術(shù)后死亡風險顯著降低（HR=0.670，95%CI：0.454～0.988，P=0.043）；在不吸煙人群中，攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風險（HR=0.616，95%CI：0.417～0.911，P=0.015）；在HBV感染人群中，攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風險（HR=0.664，95%CI：0.466～0.945，P=0.023）；在BCLC分期A/B期人群中，攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風險（HR=0.632，95%CI：0.419～0.952，P=0.028）；在單個腫瘤人群中，攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風險（HR=0.694，95%CI：0.491～0.981，P=0.038）。見表3。

表3 分層分析rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性Tab.3 Stratification analyses of association between rs8176318and OS in HCC patients after hepatectomy

2.4 rs8176318不同基因型與BRCA1 mRNA表達水平的相關(guān)性

為評估rs8176318不同基因型與BRCA1 mRNA表達水平的相關(guān)性，本研究利用GTEx數(shù)據(jù)庫中208例正常肝臟組織的 R NA?Seq 數(shù)據(jù)進行 e QTL分析。eQTL結(jié)果顯示，rs8176318 AA基因型與較低的BRCA1 mRNA表達水平相關(guān)（P＜0.001），見圖2。

圖2 rs8176318基因型與BRCA1 mRNA表達水平的相關(guān)性分析Fig.2 The correlation between BRCA1 rs8176318 genotypes and its mRNA expression levels

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)BRCA1基因miRNA結(jié)合位點上的rs8176318多態(tài)性與HCC患者術(shù)后OS相關(guān)，A等位基因可降低HCC患者術(shù)后死亡風險且rs8176318 AA基因型與較低的BRCA1 mRNA表達水平相關(guān)。這表明rs8176318可能通過影響B(tài)RCA1的轉(zhuǎn)錄水平從而影響HCC患者預(yù)后，可作為判斷HCC預(yù)后的生物標志物。

BRCA1是一個重要的DNA修復(fù)基因，主要參與機體的DNA同源重組修復(fù)。首先，BRCA1通過與abraxas?RAP80復(fù)合物結(jié)合從而被吸附到DNA雙鏈斷裂處［24］；接著，通過與CtIP和MRN復(fù)合體的交互作用參與DNA雙鏈斷裂切除［25?26］；最后，將RAD51募集到DNA損傷位點與PALB2和BRCA2等基因發(fā)生相互作用，從而完成同源重組修復(fù)，維持機體基因組的穩(wěn)定性［27］。目前研究表明，BRCA1 DNA修復(fù)基因在腫瘤進展和治療中發(fā)揮著雙刃劍的作用。一方面，在正常細胞內(nèi)，DNA修復(fù)相關(guān)基因可以通過基因修復(fù)幫助細胞抵抗自發(fā)或誘導(dǎo)的DNA損傷，抑制惡性腫瘤發(fā)生［28］。另一方面，在腫瘤細胞內(nèi)，腫瘤細胞通過增強DNA損傷的修復(fù)能力來逃逸細胞死亡，從而導(dǎo)致腫瘤細胞對放化療藥物的耐受性［29］。有研究［30］發(fā)現(xiàn)miR?NA?140過表達可以靶向抑制腫瘤細胞中DNA修復(fù)基因FEN1的表達，顯著增強乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。亦有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1高表達水平與多種癌癥耐藥和預(yù)后不良有關(guān)［31?32］。ZHAO等［33］研究表明BRCA1表達水平下調(diào)可導(dǎo)致HCC細胞的同源重組修復(fù)能力下降，同時PARP1表達水平下調(diào)可導(dǎo)致HCC細胞的堿基切除修復(fù)能力缺失，兩者發(fā)揮協(xié)同作用可造成HCC細胞不可修復(fù)的DNA損傷和細胞死亡，從而提高HCC細胞對化療藥物奧拉帕尼的敏感性。WANG等［34］發(fā)現(xiàn)小分子藥物奧拉帕尼可阻斷HCC細胞的同源重組修復(fù)和選擇性非同源末端連接修復(fù)，而DNA?PK抑制劑能阻斷HCC細胞的非同源末端連接修復(fù)，奧拉帕尼和DNA?PK抑制劑聯(lián)合使用可以完全阻斷HCC細胞的DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力，進而有效抑制HCC細胞增殖，腫瘤增長抑制率達到62.3%～83.9%。PARK等［35］研究表明乳腺癌中BRCA1蛋白過表達與患者不良預(yù)后相關(guān)。

目前越來越多的證據(jù)表明，miRNAs可能通過影響B(tài)RCA1轉(zhuǎn)錄水平參與DNA損傷修復(fù)過程，從而正確調(diào)控細胞周期和維持基因組穩(wěn)定性［36］。但是很少研究關(guān)注BRCA1基因miRNA結(jié)合位點SNP在腫瘤預(yù)后中的作用。泰國一項針對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌復(fù)發(fā)率降低與BRCA13'?UTR上SNPs 5711+421（G＞T）和5711+1286（C＞T）相關(guān)［37］。ZHU 等［38］研究也發(fā)現(xiàn)在口咽鱗狀細胞癌中位于BRCA1 miRNA結(jié)合位點上SNP rs12516（T＞C）的CC基因型可降低患者的復(fù)發(fā)風險。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)BRCA1 SNP rs8176318可影響HCC患者術(shù)后OS，AA基因型可降低患者的死亡風險。

miRNAs結(jié)合位點上的SNPs可能通過影響miRNA和靶基因的結(jié)合能力改變基因轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致基因部分功能改變［39］。本研究基于SNPinfo網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BRCA1 SNP rs8176318可能存在5個靶向結(jié)合miRNAs（has?miR?1182、has?miR?149、has?miR?345、has?miR?544和has?miR?639）。其中，has?miR?149被普遍認為是一種腫瘤抑制因子［40］，也是良好的腫瘤預(yù)后標志物［41］。ZHANG等［42］研究發(fā)現(xiàn)has?miR?149在HCC組織中的表達明顯下調(diào)，且其低表達與較差的臨床病理特征相關(guān)（包括腫瘤體積大、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚的BCLC分期）。LUO等［43］發(fā)現(xiàn)干擾has?miR?149后，HCC細胞遷移和侵襲能力均明顯增強，而且其低表達是HCC預(yù)后不良的影響因素。也有研究發(fā)現(xiàn)干擾has?miR?345后，HCC細胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力均明顯增強，而且其低表達與HCC預(yù)后不良有關(guān)［44?45］。本研究的基因型?表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，rs8176318AA基因型與較低的BRCA1 mRNA表達水平相關(guān)，因此推測rs8176318突變純合基因型AA可能通過提高miRNA與BRCA1的結(jié)合能力而抑制BRCA1 mRNA的表達水平，致使HCC細胞的同源重組修復(fù)能力下降，進而降低HCC患者術(shù)后的死亡風險，但是這一推測還需進一步進行功能學實驗驗證。

綜上所述，BRCA1 rs8176318（C＞A）AA可能通過提高miRNA與BRCA1的結(jié)合能力而抑制BRCA1 mRNA的表達水平，致使HCC細胞的同源重組修復(fù)能力下降，進而降低HCC患者術(shù)后的死亡風險。但本研究也存在一定的局限性：⑴本課題是以醫(yī)院為基礎(chǔ)的回顧性隊列研究，病例納入可能會存在入院偏倚；⑵樣本量相對較??；⑶未能收集更完整的臨床治療數(shù)據(jù)，比如患者術(shù)后接受輔助性治療等信息，未能對這些因素進行評估，可能對最終的研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，本研究結(jié)果仍需開展更大樣本量的多中心研究進行驗證。