張楊子 王璇 吳玙彤 潘淑惠 文正常 文明

摘要：本試驗(yàn)旨在研究鴨腸炎病毒（DEV）gD蛋白亞細(xì)胞定位及其對(duì)病毒感染的相關(guān)作用。本研究經(jīng)過(guò)對(duì)DEV病毒擴(kuò)增處理，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組gD基因胞外區(qū)蛋白（gDw），以兔抗gDw IgG為抗體，進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，對(duì)比病毒對(duì)照組，檢查gD蛋白在吸附、侵入以及傳播之間起到的作用。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡觀察，接種DEV后4h可見(jiàn)綠色熒光，主要在細(xì)胞核附近。持續(xù)觀察6～24h發(fā)現(xiàn)熒光隨著時(shí)間增加明顯加強(qiáng)，細(xì)胞輪廓清晰，主要存在于胞漿中。激光顯微鏡下觀察接種DEV后4h可觀察到綠色熒光，經(jīng)過(guò)PI染色12h后可見(jiàn)綠色熒光更加明顯，主要在胞漿中呈現(xiàn)，在胞核內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)特異性熒光。染色后72h可在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光，且輪廓清晰。添加兔抗gDw IgG不會(huì)影響病毒粒子吸附率，在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未產(chǎn)生明顯作用。觀察組吸附率和噬斑數(shù)與對(duì)照組有顯著差異（P<0.05），添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF，糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直徑明顯減小，證實(shí)了在DEV細(xì)胞之間傳播過(guò)程中糖蛋白D起到抵抗作用。DEF感染DEV后2h可檢查到gD基因轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)，4h后可合成gD蛋白，出現(xiàn)在核膜和核周，12h出現(xiàn)在胞漿上，72h出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。DEVgD參與病毒侵入以及細(xì)胞之間傳播的作用，對(duì)于病毒吸附不明顯，添加gDw Igw抗體后，細(xì)胞病變具有延遲反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：鴨腸炎；病毒gD蛋白；亞細(xì)胞定位；病毒感染作用

鴨腸炎即鴨瘟，是由鴨腸炎病毒（DEV）引發(fā)的禽類(lèi)感染傳染病，具有較強(qiáng)的傳染性，發(fā)病急，死亡率高[1]。一般情況下，禽類(lèi)感染潛伏期約為3～5d，患病鴨表現(xiàn)出愛(ài)獨(dú)處，頭頸卷縮，雙腳麻痹，羽毛松亂，不愿意行走。隨著病情惡化開(kāi)始腹瀉，排泄物呈白色或綠色，有腥臭味，食欲減退、肛門(mén)紅腫[2]。經(jīng)過(guò)解剖，患鴨出現(xiàn)體腔積血以及組織出血，存在器官壞死。gD蛋白亞細(xì)胞是病毒傳播的重要蛋白，具有中和病毒作用，作為一種中和抗原，能夠誘導(dǎo)保護(hù)反應(yīng)，鴨腸炎疫苗就是通過(guò)將病毒結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原免疫，從而達(dá)到預(yù)防作用。通過(guò)研究gD蛋白定位和感染病毒作用，能夠?qū)崿F(xiàn)鴨腸炎的預(yù)防和治療。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

采購(gòu)10日齡左右的鴨胚，制備鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）[3]。采購(gòu)鴨腸炎病毒弱病株。準(zhǔn)備分子生物學(xué)試劑以及生化試劑。準(zhǔn)備DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、低熔點(diǎn)瓊脂糖。配置PBS緩沖液、甲醇固定液以及碳酸鹽緩沖液等。

1.2方法

1.2.1 gD蛋白亞細(xì)胞定位根據(jù)gD基因序列，收集不同感染時(shí)間的DEF，并取正常細(xì)胞為對(duì)照組。提取RNA，經(jīng)過(guò)酶處理后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將產(chǎn)物電泳處理。將DEV接種在載玻片上，接種1、2、4、6、12、24、72h后收獲細(xì)胞。使用PBS溶液進(jìn)行單層細(xì)胞的沖洗，同時(shí)使用多聚甲醛進(jìn)行固定處理，重復(fù)沖洗3次。使用PBS溶液處理細(xì)胞。沖洗后使用羊抗兔IgG孵育1h，用PI染色液染色處理，再次用PBS沖洗，固定在載玻片上，進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.2.2 gD蛋白對(duì)病毒的感染作用

1）吸附作用。將病毒溶解于DMEM（無(wú)血清）、兔抗gDw IgG、兔陰性血清中，接種單層DEF，處理2h去除接種物，使用PBS進(jìn)行沖洗，將沒(méi)有結(jié)合的游離粒子沖洗干凈。在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組不需進(jìn)行沖洗，直接覆蓋低熔點(diǎn)瓊脂糖。

2）侵入作用。將病毒溶解于DMEM（無(wú)血清）、兔抗gDw IgG、兔陰性血清中，在37℃條件下進(jìn)行處理1h，丟棄接種物。對(duì)照組使用PBS溶液進(jìn)行清洗，觀察組使用醋酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，經(jīng)過(guò)2min處理后，侵入粒子完全滅活。

3）傳播作用。使用半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂充分吸收釋放病毒粒子，DEV通過(guò)細(xì)胞之間直接傳播形成噬斑。用病毒進(jìn)行接種，然后覆蓋有DMEM的營(yíng)養(yǎng)瓊脂經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后形成噬斑。進(jìn)行染色處理后，測(cè)量噬斑直徑。觀察組中含有兔抗gDw IgG。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件處理數(shù)據(jù)，使用t檢驗(yàn)計(jì)量資料，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；使用卡房檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料（%），P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 gD蛋白亞細(xì)胞定位

經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡觀察，正常DEF在激發(fā)光下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性熒光，經(jīng)過(guò)PI染色后呈紅色，可見(jiàn)橢圓形清晰輪廓。接種DEV后4h可見(jiàn)綠色熒光，主要在細(xì)胞核附近。持續(xù)觀察6～24h發(fā)現(xiàn)熒光隨著時(shí)間增加明顯加強(qiáng)，細(xì)胞輪廓清晰，主要存在于胞漿中。激光顯微鏡下沒(méi)有觀察到DEF出現(xiàn)特異性綠色熒光。觀察組接種DEV后4h可觀察到綠色熒光，經(jīng)過(guò)PI染色12h后可見(jiàn)綠色熒光更加明顯，主要在胞漿中呈現(xiàn)，在胞核內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)特異性熒光。染色后72h可在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光，且輪廓清晰。

2.2病毒gD蛋白對(duì)病毒吸附前后噬斑的變化

觀察組處理后噬斑（64.71±2.54）個(gè)，吸附率（71.29±1.34）%。2組對(duì)比，無(wú)明顯差異。具體結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.3病毒gD蛋白對(duì)病毒侵入前后噬斑的變化

觀察組處理后噬斑（51.56±1.70）個(gè)，侵入率（65.12±2.31）%。兩組對(duì)比，差異顯著（P<0.05）。具體結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.4病毒gD蛋白對(duì)細(xì)胞間傳播前后噬斑的變化

觀察組噬斑直徑（1.25±0.06）mm。兩組對(duì)比，差異顯著（P<0.05）。具體結(jié)果詳見(jiàn)表3。

3討論

gD是病毒囊膜的重要構(gòu)成部分，對(duì)病毒侵入細(xì)胞有重要意義，負(fù)責(zé)病毒包膜的融合和病毒釋放與擴(kuò)散的介導(dǎo)作用。在病毒復(fù)制和中和抗體中g(shù)D也產(chǎn)生重要作用，是體液免疫、宿主細(xì)胞免疫的重要靶標(biāo)。若病毒缺少gD基因，無(wú)法和細(xì)胞膜發(fā)生吸附作用，將造成病毒失去感染能力[4]。在病毒基因組中有至少80多個(gè)基因產(chǎn)物，但合成gD主要出現(xiàn)在病毒感染的早期，在DNA復(fù)制后合成，當(dāng)病毒復(fù)制活躍后，6～12h開(kāi)始大量聚集。通過(guò)免疫熒光技術(shù)可觀察到感染4h后gD在核周囊泡上定位[5]。本研究也顯示，經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡觀察，正常DEF在激發(fā)光下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性熒光，經(jīng)過(guò)PI染色后呈紅色，可見(jiàn)橢圓形清晰輪廓。接種DEV后4h可見(jiàn)綠色熒光，主要在細(xì)胞核附近。持續(xù)觀察6～24h發(fā)現(xiàn)熒光隨著時(shí)間增加明顯加強(qiáng)，細(xì)胞輪廓清晰，主要存在于胞漿中。使用激光顯微鏡進(jìn)行觀察，沒(méi)有觀察到DEF出現(xiàn)特異性綠色熒光。觀察組接種DEV后4h可觀察到綠色熒光，經(jīng)過(guò)PI染色12h后可見(jiàn)綠色熒光更加明顯，主要在胞漿中呈現(xiàn)，在胞核內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)特異性熒光。染色后72h可在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光，且輪廓清晰?？梢?jiàn)gD定位表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，和gD發(fā)揮功能以及DEF增殖存在密切關(guān)聯(lián)性。在感染后4～6h為糖蛋白合成的活躍時(shí)期，從核膜向胞漿上轉(zhuǎn)移，顯微鏡可觀察到綠色熒光增加。感染24h后gD大量合成，胞漿內(nèi)病毒數(shù)量增加，向胞外釋放。在72h后觀察到細(xì)胞膜上出現(xiàn)明顯綠色熒光。

經(jīng)本試驗(yàn)研究，添加gD抗體后會(huì)延遲DEV病變的發(fā)生，病變局限在少數(shù)細(xì)胞中，無(wú)法形成大范圍噬斑，也證明了DEV感染過(guò)程是一個(gè)膜融合的過(guò)程。本研究顯示，添加兔抗gDw IgG不會(huì)影響病毒粒子吸附率，在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未產(chǎn)生明顯作用。主要對(duì)病毒侵入和細(xì)胞之間感染產(chǎn)生抑制作用。gD并不會(huì)錨定包膜上，gD抗體中和病毒會(huì)造成病毒gD數(shù)量減少，從而影響病毒的侵入以及傳播，最終造成病變延遲。本研究也顯示，觀察組處理后噬斑（51.56±1.70）個(gè)，侵入率（65.12±2.31）%。觀察組與對(duì)照組對(duì)比，差異顯著，證實(shí)觀察組吸附率和噬斑數(shù)和對(duì)照組有顯著差異，添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF，糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。觀察組與對(duì)照組對(duì)比，差異顯著。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直徑明顯減小，證實(shí)了在DEV細(xì)胞之間傳播過(guò)程中糖蛋白D起到抵抗作用。目前關(guān)于gD蛋白的基因研究還相對(duì)較少，未來(lái)還需要針對(duì)gD亞單位疫苗、gD核酸疫苗展開(kāi)研究，從而有效預(yù)防和治療鴨腸炎。

4小結(jié)

綜上所述，DEF感染DEV后2h可檢查到gD基因轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)免疫熒光試驗(yàn)，4h后可合成gD蛋白，出現(xiàn)在核膜和核周，12h出現(xiàn)在胞漿上，72h出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。DEVgD參與病毒侵入以及細(xì)胞之間傳播的作用，對(duì)于病毒吸附不明顯，添加gDw Igw抗體后，細(xì)胞病變具有延遲反應(yīng)。█

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