唐 露 羅太明 諶倫富 黃傳書

(重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700)

生育酚又被稱作維生素E，是一類脂溶性強抗氧化劑的同類物質(zhì)統(tǒng)稱，其根據(jù)甲基數(shù)目和位置的不同分為α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚4種形式。生育酚是生物體內(nèi)一種十分重要的微量營養(yǎng)成分，人體缺乏生育酚會引起生殖系統(tǒng)萎縮和損害[1]。已有的研究表明，生育酚參與功能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控及抗低溫脅迫等多種代謝途徑，在提高動物和人體免疫力及應(yīng)激能力、維持正常的生殖功能、清除細(xì)胞自由基、抑制不飽和脂肪酸酸敗，以及在發(fā)揮對植物光合器官的保護(hù)功能等方面都有十分重要的作用[1-3]。然而，具有重要生物學(xué)功能的生育酚卻只能在具有光合作用的植物中合成，人體和動物均不能在體內(nèi)合成生育酚，只能通過食用植物性食品或提純的維生素E膠囊獲得[4]。近年來，天然維生素E每年的需求增長達(dá)10%，但中國的天然維生素E產(chǎn)品較少，市場幾乎被美國、德國、日本等國家壟斷。人工合成維生素E的生物活性與天然維生素E相差甚遠(yuǎn)[5]，因此很有必要挖掘更多高維生素E含量的天然維生素植物源。

桑樹(MorusalbaL.)在中國有幾千年栽植歷史，有著豐富的種質(zhì)資源，傳統(tǒng)栽桑主要用于養(yǎng)蠶繅絲。應(yīng)用現(xiàn)代藥學(xué)與檢測技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，桑樹的葉、果、枝、根中含有生物堿、黃酮、多糖、多酚、氨基酸及豐富的維生素等功能性活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)具有抗炎[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、降血壓[10]、清除自由基[11]等多種功效。桑樹在營養(yǎng)保健領(lǐng)域的開發(fā)利用價值已被逐漸重視，但目前對桑樹功能活性物質(zhì)的研究主要集中在1-脫氧野尻霉素(DNJ)、黃酮類物質(zhì)、花青素、多酚及多糖等幾大類，關(guān)于桑樹中生育酚的種類及含量研究則鮮有報道。鑒于此，本研究擬對桑葉和桑椹中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量進(jìn)行系統(tǒng)測定和分析，以期為桑樹來源天然維生素E的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年5月4日上午9時(晴天)，在重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院桑樹資源圃分別隨機選擇“中桑5801”和“北桑1號”2個桑品種樹齡35年且長勢基本一致的桑樹各5株，每株從同側(cè)、中上段采摘完全成熟的桑葉和桑椹，并將各品種5株桑樹采摘的桑葉、桑椹分別混合后用去離子水沖洗，吸水紙吸干水分后，隨即放入裝有干冰的泡沫箱，帶回實驗室先放入-20 ℃、-40 ℃分別冷藏適應(yīng)1 h，隨后保存至超低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

甲醇(色譜級，上海安譜)，超純水。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)。

干式氮吹儀(無錫沃信儀器)，島津LC-20AT液相色譜儀(日本島津)，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm，日本島津)，TLG-16低溫離心機(湖南湘儀)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)液配制

分別精密稱取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品 1 mg，置于1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制為質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的混標(biāo)儲備液。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封后在-20 ℃下避光保存6個月，作為對照。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制的對照品儲備液用甲醇配制成含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚分別為100 μg/mL的混合對照品溶液，取此溶液1 mL，用甲醇分別稀釋至2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL共6個質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，取各個濃度上述溶液進(jìn)樣10 μL測定。以HPLC測得色譜峰面積(Y)與標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)進(jìn)行線性回歸分析。

1.5 待測樣品液制備

將供試的桑葉、桑椹材料經(jīng)高通量植物組織研磨器磨碎后，精確稱取0.2 g樣本，加入1%BHT乙醇溶液1 mL，混勻后加入100 g/L氫氧化鉀溶液1 mL，混勻于85 ℃恒溫提取40 min。冷卻后加入2 mL石油醚振蕩萃取10 min，取出醚相層，用超純水清洗3次后，氮吹至干，加入1 mL甲醇復(fù)溶，用針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)待測。

1.6 測定方法

1.6.1 液相條件

用島津LC-20AT高效液相色譜儀測定。C18色譜柱：250 mm×4.6 mm，5 μm。流動相：超純水(流動相B)與甲醇(流動相A)的體積比為10∶90。

1.6.2 梯度洗脫程序

開啟電腦、檢測器和泵，安裝色譜柱，然后打開軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量為10 μL，流速1 mL/min，柱溫20 ℃，設(shè)置梯度洗脫程序(表1)，走樣時間為35 min，檢測波長294 nm，設(shè)置完畢保存方法組。用流動相過柱子，待基線穩(wěn)定后開始加樣。

表1 樣品中4種生育酚含量檢測的梯度洗脫條件

1.7 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品6份，每份0.2 g，按方法“1.5”制備待測樣品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄4種成分的峰面積。以峰面積為指標(biāo)計算重復(fù)性。

1.8 穩(wěn)定性試驗

精密稱取供試樣品0.2 g，按方法“1.5”制備待測樣品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h取樣10 μL測定色譜峰面積。

1.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品6份，每份0.2 g，分別加入對照品0.05 mg，用60%甲醇定容至刻度，按方法“1.4”平行制備，進(jìn)樣10 μL，計算加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

配制的4種生育酚對照標(biāo)液測定結(jié)果如圖1所示，4種生育酚標(biāo)準(zhǔn)品分別在20.84 min(α-生育酚)、24.20 min(β-生育酚)、25.15 min(γ-生育酚)、27.28 min(δ-生育酚)出現(xiàn)峰值。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以生育酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)計算得到各成分的校正曲線，具體如表2所示。從4種生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分析看出，標(biāo)液生育酚中4種有效成分的R2均>0.999[12]，表明其線性關(guān)系良好。

圖1 4種生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

表2 4種生育酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.1.2 儀器的精密度

用所配制的生育酚標(biāo)準(zhǔn)液對本試驗使用儀器的精密度進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為1.10%、1.12%、0.60%和0.89%，均<0.05[13]，表明本試驗測定儀器精密度良好，在可接受范圍內(nèi)。

2.1.3 方法的重復(fù)性

重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚RSD值分別為3.22%、4.77%、4.57%和2.67%，均<0.05[13]，表明該檢測方法重復(fù)性較好，在可接受范圍內(nèi)。

2.1.4 樣品溶液的穩(wěn)定性

分對0 h、4 h、8 h、12 h、24 h獲取的樣品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性測試。結(jié)果顯示α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的RSD值分別為2.78%、4.38%、4.19%、3.44%，表明在0～24 h時間段內(nèi)，供試樣品溶液性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率

供試樣品的加樣回收率測試結(jié)果表明，4種生育酚的平均回收率分別為94.77%、96.15%、97.37%、98.58%，其RSD值分別為1.82%、3.33%、2.98%、3.24%(表3)。

表3 4種生育酚的加樣回收率測試結(jié)果 回收率/%

2.2 桑葉和桑椹樣品中的4種生育酚含量

采用HPLC法對2個桑品種的桑葉和桑椹樣品中的生育酚成分及含量進(jìn)行檢測的結(jié)果如表4、圖1所示，桑葉和桑椹中均含有4種生育酚。桑葉中含α-生育酚最多，中桑5801和北桑1號的占比分別為47.65%、62.49%；其次為δ-生育酚，2個品種的占比分別為33.3%、20.91%。桑椹中含γ-生育酚最多，2個品種的占比分別為44.67%、66.65%，其次為δ-生育酚，2個品種的占比分別為40.11%、28.73%，而生物活性最高的α-生育酚在桑椹中含量極低，2個品種的占比僅分別為5.13%和3.54%?？傮w而言，桑葉中總生育酚含量顯著高于桑椹，2個品種桑葉中的總生育酚含量分別為桑椹的3.88倍、2.35倍，2個品種桑葉中的α-生育酚含量分別是桑椹的36.12倍、41.46倍。

表4 2個供試桑品種桑葉和桑椹中的4種生育酚檢測結(jié)果 質(zhì)量比/(μg·g-1，mf)

注：不同小寫字母表示同一部位不同成分生育酚差異顯著；**表示同一生育酚成分不同部位差異顯著。

3 討 論

本試驗采用HPLC法對“中桑5801”“北桑1號”2個桑品種桑葉和桑椹中的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明：2個桑品種的桑葉和桑椹中均含有4種生育酚，桑葉和桑椹中4種生育酚含量差異顯著(P<0.05)；桑葉中的總生育酚含量顯著高于桑椹中的總生育酚含量，桑葉中的生育酚以α-生育酚為主，桑椹中的生育酚以γ-生育酚為主。

桑樹作為一種藥用植物資源，對其活性物質(zhì)的深入研究具有重要意義。據(jù)已有的研究記載，生育酚在紫花苜蓿葉片中的平均質(zhì)量比為31.81 μg/g[14]，而在萵苣葉中的質(zhì)量比僅為0.2～0.8 μg/g[15]。本試驗檢測2個桑品種桑葉中的生育酚質(zhì)量比均值為72.1 μg/g，顯著高于上述2種植物，且桑葉中表現(xiàn)生育酚主要生物活性的α-生育酚含量最高，表明桑葉可作為天然維生素E提取及利用的植物原料。本試驗為后續(xù)桑葉生育酚的提取純化，生物活性鑒定以及高生育酚含量桑樹品種的篩選奠定了良好基礎(chǔ)。然而，本試驗僅對2個桑品種的桑樹成熟葉片和桑椹進(jìn)行了取樣測定，今后將對更多桑品種不同發(fā)育期的植株及不同器官部位中的各種生育酚含量進(jìn)行檢測，并探究其變化。