孫曼萁 魏 欣 石 敏 朱 勇

(1.西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市萬州第一中學(xué)，重慶 萬州 404000)

樂果(Dimethoate)是內(nèi)吸性有機(jī)磷殺蟲、殺螨劑，對害蟲和螨類有強(qiáng)烈的觸殺作用和一定的胃毒作用[1]，其作用機(jī)制是抑制昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶，阻礙神經(jīng)傳導(dǎo)而導(dǎo)致死亡[2]。然而樂果的使用也給農(nóng)業(yè)環(huán)境的有益生物帶來了污染危害[3]，如對土壤動(dòng)物呼吸強(qiáng)度具有明顯抑制作用[4]。這種污染危害甚至可通過食物鏈傳至整個(gè)農(nóng)業(yè)環(huán)境的生物鏈，因而降低生物的多樣性。已有的研究明確樂果具有潛在的致畸、致突變和致癌作用[5]，其在生物體內(nèi)經(jīng)氧化代謝形成的氧化樂果，會(huì)毒害生物的神經(jīng)，抑制免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致組織細(xì)胞和DNA損傷[6]，用樂果處理小鼠的骨骼肌細(xì)胞不僅限制了細(xì)胞活力且使細(xì)胞凋亡率明顯增加[7]。陳建秋等[8]的研究還顯示樂果對輪蟲有一定的生殖干擾作用，會(huì)影響個(gè)體發(fā)育與性成熟周期和產(chǎn)卵量。

家蠶(BombyxmoriL.)屬于鱗翅目的模式昆蟲，是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲[9-10]，其經(jīng)過漫長的人工選擇和馴養(yǎng)，對不良環(huán)境因子的抵抗性較弱[11]，生產(chǎn)上常有因?yàn)檗r(nóng)藥污染桑葉使家蠶急性或慢性中毒而造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的事件發(fā)生[12-13]。關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥對農(nóng)業(yè)環(huán)境有益昆蟲的生殖毒性備受關(guān)注。在本研究中，我們以家蠶作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠碓u估樂果對于昆蟲的生殖毒性，以利于綜合評價(jià)蠶區(qū)使用樂果殺蟲對家蠶等農(nóng)業(yè)環(huán)境有益昆蟲的危害性[14]。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

選用871和872兩個(gè)家蠶品種供試，由重慶市蠶業(yè)科學(xué)研究院提供。蟻蠶孵化收蟻后，1～4齡幼蟲正常環(huán)境下飼養(yǎng)(25 ℃恒溫，相對濕度75%±5%，人工氣候箱光周期12L±12D)，每天采摘新鮮桑葉喂養(yǎng)3次。

1.2 試蟲處理及取樣

將樂果(DMT，40%乳油，重慶市化工集團(tuán)，生產(chǎn)批號：PD85121-3)用蒸餾水按照一定比例(

1.3 產(chǎn)卵性能和子代孵化率調(diào)查

在雌蛾產(chǎn)卵結(jié)束后將蛾圈置于25 ℃光照下催青，12 d后調(diào)查產(chǎn)卵數(shù)、受精卵數(shù)和孵化卵數(shù)，計(jì)算造卵數(shù)、產(chǎn)卵數(shù)、受精率和孵化率。每一個(gè)處理組調(diào)查個(gè)體數(shù)為6頭，均做5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 幼蟲生殖腺指數(shù)的計(jì)算

在子代家蠶發(fā)育至5齡5 d，各濃度藥液處理組中隨機(jī)取幼蟲(雌、雄各10頭)于冰浴條件下解剖其生殖腺并稱量。使用以下公式計(jì)算精巢和卵巢的臟器系數(shù)：生殖腺指數(shù)=(器官質(zhì)量/體質(zhì)量)×100。

1.5 幼蟲生殖腺的組織形態(tài)學(xué)觀察

上述解剖取得的子代家蠶幼蟲生殖腺在4 %多聚甲醛中固定24 h后，經(jīng)乙醇梯度(50%、70%、80%、85%、90%、95%、無水)脫水，經(jīng)二甲苯與無水乙醇1∶1混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蠟包埋，做連續(xù)切片，厚度5 μm，攤片機(jī)上40 ℃烘干。再進(jìn)行二甲苯脫蠟，HE染色，顯微鏡(Lacia)下觀察拍照。

1.6 幼蟲生殖腺的抗氧化酶活性檢測

根據(jù)制造商的說明，使用酶活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，江蘇蘇州)測定子代家蠶幼蟲生殖腺中的SOD和CAT酶活性。檢測樣本制作參照文獻(xiàn)[15]的方法。

1.7 抗氧化酶及生殖發(fā)育相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

取子代家蠶5齡5 d幼蟲的生殖腺提取總RNA。提取的各樣品總RNA用核酸分析儀測定其濃度并經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測其完整性后，于-80 ℃條件下保存。根據(jù)各樣品RNA濃度, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物, 并送于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。采用TB GreenTM PremixExTaqTMII試劑盒(TakaRa, 中國)熒光定量PCR檢測各樣品中與氧化應(yīng)激相關(guān)的cat和sod基因以及與生殖發(fā)育相關(guān)基因(Ovo、Vg、Sxl-S、Achi-L、Aly、Vlg)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平, 以家蠶Actin3作為內(nèi)參，3個(gè)重復(fù)?；虻谋磉_(dá)水平采用2-ΔΔCt法[16]計(jì)算, 并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表1 家蠶抗氧化酶基因和生殖發(fā)育相關(guān)基因的引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL2010和SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，處理組與對照組之間的差異采用Tukey氏檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以0.05作為顯著性水平。依據(jù)3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因mRNA轉(zhuǎn)錄定量檢測和酶活性測定的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樂果脅迫對家蠶產(chǎn)卵性能和子代孵化率的影響

家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后正常上蔟結(jié)繭，羽化后進(jìn)行雜交(871×872)和自交(871×871)的產(chǎn)卵性能如表2和表3所示。與對照組相比，處理組的產(chǎn)卵數(shù)、轉(zhuǎn)色卵數(shù)、孵化率、死卵率是隨著添食樂果藥液濃度的增加而減少。在雜交組中，轉(zhuǎn)色卵數(shù)在200 mg/L樂果藥液處理組與對照組存在顯著差異(P<0.05)；蠶卵孵化率100 mg/L樂果藥液處理組與對照組存在顯著差異(P<0.05)，200 mg/L樂果藥液處理組與對照組存在極顯著差異(P<0.01)。在自交組中，100～200 mg/L樂果藥液處理組相比對照組，其產(chǎn)卵數(shù)、轉(zhuǎn)色卵數(shù)和孵化率都出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。因此可以推測，家蠶添食樂果引起的慢性中毒對產(chǎn)卵、受精以及孵化都有一定的影響，且對于自交組的影響更加顯著。

表2 家蠶5齡幼蟲添食樂果后雜交組(871×872)產(chǎn)卵性狀的影響

表3 家蠶5齡幼蟲添食樂果后對自交組(871×871)產(chǎn)卵性狀的影響

2.2 樂果脅迫對子代家蠶幼蟲生殖腺指數(shù)的影響

精巢和卵巢是許多生殖毒物的重要靶器官，而性腺指數(shù)是脅迫后的毒性測量常用參數(shù)之一，可以直觀反映化學(xué)物質(zhì)對靶器官的毒性作用。調(diào)查結(jié)果表明：家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后，雜交組子代幼蟲雌雄個(gè)體的生殖腺指數(shù)較對照組都呈現(xiàn)下降趨勢(圖1-A)，并且100 mg/L和200 mg/L處理組的雌性生殖腺指數(shù)較對照組均表現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)；自交組子代幼蟲生殖腺指數(shù)也呈現(xiàn)下降趨勢(圖1-B)。

比較雜交組和自交組子代的生殖腺指數(shù)變化，結(jié)果表明非致死劑量的樂果脅迫導(dǎo)致家蠶慢性中毒在自交組引起子代雌性幼蟲和雄性幼蟲生殖腺指數(shù)下降的幅度大于雜交組。

2.3 樂果脅迫對家蠶子代幼蟲生殖腺形態(tài)的影響

取家蠶子代5齡5 d雄性幼蟲的精巢進(jìn)行組織切片，雜交組和自交組子代雄性幼蟲的精巢組織結(jié)構(gòu)觀察如圖2所示：對照組雄性幼蟲的精巢外膜中細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，精巢內(nèi)膜向內(nèi)延伸形成3片隔膜，精巢中的細(xì)胞排列整齊，且有精子束出現(xiàn)；各處理組隨著樂果藥液濃度的提高，子代雄性幼蟲的精巢組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，睪丸外膜和包圍的結(jié)締組織變薄且出現(xiàn)破碎，高濃度處理組子代雄性幼蟲的生精囊可以觀察到明顯破裂，精細(xì)胞排列間隙較大，細(xì)胞排列散亂，且腔內(nèi)出現(xiàn)碎片。

A～D依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后雜交組子代5齡雄性幼蟲的精巢切片；E～K依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后自交組子代5齡雄性幼蟲的精巢切片。實(shí)線箭頭所示為空泡，虛線箭頭所示為損傷的精母細(xì)胞。

子代5齡5 d雌性幼蟲的卵巢組織切片觀察如圖3所示：對照組的卵巢卵細(xì)胞排列較為整齊，且均勻分布于卵巢中；處理組與對照組相比，卵細(xì)胞分布不均，且隨著樂果脅迫濃度的增大，卵巢中細(xì)胞數(shù)目也相對減少，細(xì)胞間出現(xiàn)空泡。

A～D依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后雜交組子代5齡雌性幼蟲的卵巢切片；E～K依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后自交組子代5齡雌性幼蟲的卵巢切片。實(shí)線箭頭所示為空泡。

通過比較雜交組和自交組子代5齡幼蟲生殖腺切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見在相同濃度樂果處理下，自交組子代比雜交組子代的生殖腺普遍受損程度更大。這一結(jié)果表明，以非致死劑量的樂果脅迫導(dǎo)致的慢性中毒會(huì)對家蠶子代的生殖腺產(chǎn)生嚴(yán)重影響，且對自交組子代的影響程度更大。

2.4 樂果脅迫對家蠶子代幼蟲生殖腺抗氧化酶活性及基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

2.4.1 SOD酶活性及基因mRNA轉(zhuǎn)錄變化

SOD能清除超氧陰離子自由基(O2-)，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡至關(guān)重要。家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后，雜交組子代幼蟲生殖腺中的SOD酶活性相較于對照組總體呈現(xiàn)上升趨勢(圖4-A)。其中，處理組子代雌性幼蟲隨添食樂果藥液濃度的上升SOD酸活性較對照顯著升高(P<0.01)，高濃度樂果藥液處理組子代幼蟲的SOD酶活性較對照組有極顯著性差異(P<0.01)，表明此時(shí)由樂果脅迫產(chǎn)生的氧化自由基可完全被歧化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各處理組子代幼蟲生殖腺中sod基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照組均呈現(xiàn)出下降的趨勢(圖4-B)。檢測到的酶活性和基因mRNA轉(zhuǎn)錄的變化不一致，可能是因?yàn)镾OD酶活性存在不完全依賴基因轉(zhuǎn)錄的翻譯過程和翻譯后蛋白質(zhì)水平的調(diào)控[17]。

從圖4-C,D顯示的結(jié)果還可見：處理組自交子代雌性和雄性幼蟲生殖腺的SOD酶活性隨添食樂果藥液濃度的增加而極顯著降低，并且sod基因mRNA轉(zhuǎn)錄的趨勢與之具有一致性。

A、B為雜交組，C、D為自交組。

2.4.2 CAT酶活性及基因mRNA轉(zhuǎn)錄變化

機(jī)體內(nèi)的SOD具有將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2的功能，而CAT可繼續(xù)分解H2O2，從而降低體內(nèi)H2O2的濃度，SOD和CAT構(gòu)成了機(jī)體應(yīng)對外界脅迫的第一道防線[18]。

家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后，在雜交組子代幼蟲生殖腺中的CAT酶活性隨著添食樂果濃度的增加而先降低后增加(圖5-A)。由圖5-B可見：處理組雜交組子代雌蠶生殖腺中的cat基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先上升(50 mg/L樂果藥液處理組)再極顯著下調(diào)趨勢，出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞受害后的基因轉(zhuǎn)錄水平回落；而處理組雜交組子代雄蠶生殖腺中的cat基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨樂果添食濃度提高呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)(P<0.05)，然后極顯著(P<0.01)上升的趨勢。

A、B為雜交組，C、D為自交組。

自交組子代幼蟲生殖腺中的CAT酶活性變化與雜交組相似，并出現(xiàn)了細(xì)胞受害后cat基因轉(zhuǎn)錄水平回落(圖5-C、D)。推測家蠶經(jīng)非致死劑量樂果脅迫后，子代幼蟲生殖腺中CAT酶活性激活系統(tǒng)受到影響時(shí)，能夠動(dòng)員cat基因的上調(diào)表達(dá)，以緩解樂果慢性中毒對生殖細(xì)胞的危害[19]。

2.5 樂果脅迫對家蠶子代幼蟲生殖發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

Vg是卵黃蛋白的前體基因，而卵黃蛋白是家蠶胚胎發(fā)育的營養(yǎng)來源，Ovo基因與卵巢的發(fā)育密切相關(guān)，Sxl-S也是作為生殖發(fā)育相關(guān)基因[20-22]。家蠶5齡幼蟲添食樂果藥液后，雜交組子代雌性幼蟲卵巢生殖發(fā)育相關(guān)基因Vg、Sxl-S、Ovo的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在樂果藥液處理下，與對照組相比，在50 mg/L呈現(xiàn)上升趨勢，在100～200 mg/L均呈現(xiàn)及顯著性下降趨勢(圖6-A～C)，且分別下降44.5%、49.9%、29.9%。在不同濃度樂果藥液處理組，自交組子代子雌性幼蟲較雜交組相比均呈現(xiàn)極顯著性下調(diào)(圖6-D～F)，即樂果脅迫對自交組子代的生殖發(fā)育影響更大。

A～C為雜交組，D～F為自交組。

Achi-L、Aly、Vlg基因與精巢發(fā)育的能量代謝和配子分化相關(guān)[23]。樂果脅迫后，基因Achi-L、Aly、Vlg在精巢中出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，隨著不同濃度樂果藥液的處理，基因的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的下降。其中經(jīng)200 mg/L樂果藥液處理后的雜交組子代檢測到的結(jié)果與對照組相比，分別下調(diào)表達(dá)9.74倍、1.99倍、1.83倍；自交組子代檢測到分別下調(diào)表達(dá)了14.76倍、4.86倍、1.66倍。結(jié)果表明，樂果脅迫對家蠶自交子代的蠶卵影響更大。

A～C為雜交組，D～F為自交組。

3 討 論

有機(jī)磷農(nóng)藥常被用作殺蟲劑，若操作不慎殘留在水果、蔬菜上，就會(huì)進(jìn)入有機(jī)體造成傷害[24]，如小鼠[25]、蚯蚓[26]、鯉魚[27]的研究已經(jīng)證實(shí)了樂果毒性的存在。有報(bào)道樂果會(huì)導(dǎo)致高萼花臂尾輪蟲的種群增長率和凈生殖率顯著下降[28]。對雄性小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入小劑量樂果會(huì)對其生殖系統(tǒng)及其胎鼠發(fā)育有一定程度的危害[29]。

抗氧化防御系統(tǒng)是昆蟲抗逆機(jī)制的一個(gè)重要組成部分。機(jī)體為保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，通過含有的多種酶類清除活性氧以維持體內(nèi)氧化還原平衡，其中最重要的酶包括 SOD和CAT等[30]。在本實(shí)驗(yàn)中，家蠶5齡幼蟲添食非致死劑量樂果后，子代幼蟲生殖腺中的sod基因mRNA水平下降到很低的水平，這可能會(huì)導(dǎo)致沒有足夠能力清除樂果脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子，進(jìn)而損傷生殖腺組織和細(xì)胞，影響子代家蠶的正常生殖生理活動(dòng)。家蠶5齡幼蟲添食高濃度樂果藥液后，子代幼蟲生殖腺的CAT酶活出現(xiàn)顯著上升，這與Shadegan等[31]研究樂果處理鯉魚后的結(jié)論具有一致性。

睪丸是精子生長發(fā)育的主要部位，而精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)能力和形態(tài)是決定生育力的重要因素[32]。通過對子代家蠶5齡5 d幼蟲的精巢組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，樂果會(huì)對子代的精子數(shù)量和生精囊發(fā)育造成影響，這與Jallouli等[33]研究的樂果對雄性小鼠生殖參數(shù)的影響結(jié)果一致。卵巢是產(chǎn)生卵子的重要部位，是研究農(nóng)藥雌性生殖毒性的常用指標(biāo)之一[34]。在對子代家蠶5齡5 d幼蟲卵巢的組織切片中發(fā)現(xiàn)，隨著樂果處理濃度的增大，卵巢中細(xì)胞數(shù)目以及卵細(xì)胞受到的影響越大，這與Mahadevaswami等[35]研究結(jié)果具有一致性。

Vg是卵黃蛋白的前體基因，而卵黃蛋白是卵生動(dòng)物胚胎發(fā)育時(shí)期的主要能源物質(zhì)[36]。卵子形成過程中卵黃蛋白生成數(shù)量對于胚胎發(fā)生和早期幼體維持生命所需營養(yǎng)物質(zhì)的提供有至關(guān)重要的作用[37]。薛高旭等[38]和宋作偉等[39]發(fā)現(xiàn)BmOvo基因可能參與家蠶卵子的形成，BmOvo下調(diào)表達(dá)會(huì)引起雌蛹體質(zhì)量、繭層量和雌蛾造卵數(shù)均出現(xiàn)下降趨勢。Achi-L、Aly、Vlg基因與家蠶精巢發(fā)育的能量代謝和配子分化相關(guān)。盛潔等[40]研究發(fā)現(xiàn)，注射了Achi-si RNA-2的蠶蛾正常交配所產(chǎn)卵中的不受精卵率增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，家蠶5齡幼蟲添食非致死劑量樂果后，子代雌蠶生殖腺中的Ovo、Vg和Sxl-S基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，子代雄蠶生殖腺中的Achi、Aly、Vlg基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，此結(jié)果提示家蠶因樂果脅迫導(dǎo)致的慢性中毒，可能對家蠶子代的生殖能力有一定影響。

本研究結(jié)果表明：家蠶5齡幼蟲添食低濃度樂果藥液導(dǎo)致的慢性中毒，可以使家蠶產(chǎn)下卵的孵化率、受精率等出現(xiàn)明顯下降，并且會(huì)影響到子代的生殖發(fā)育，導(dǎo)致子代家蠶生殖腺細(xì)胞損傷，且促使子代生殖腺中的過氧化加劇，抗氧化酶活性及其相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，從而引起生殖腺抗氧化系統(tǒng)紊亂，抑制生殖發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究結(jié)果還表明，家蠶因樂果脅迫慢性中毒對自交組子代生殖發(fā)育的影響更為明顯，故生產(chǎn)上推廣雜交組合也在一定程度上使危害降低。