王廣宇 王 雨 王雷永 徐旭英

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科，北京 100010)

與糖尿病有關的瘡面，在破潰前已經有隱性損傷，破潰后愈合過程中常停滯于某一階段，從而影響了正常的愈合過程，轉變?yōu)殡y愈合的慢性創(chuàng)面，是臨床上的治療難點之一[1]。中醫(yī)在慢性創(chuàng)面局部辨證方面經驗豐富，其中局部具有顏色黯、生長乏力、滲出較少特點的瘡面，屬于血瘀型瘡面[2-3]。局部微循環(huán)障礙是血瘀型創(chuàng)面發(fā)生原因之一，由于某些因素如炎癥因子、細菌感染等導致暫時性血管舒縮功能失調，從而引起局部供血不足缺血，改變創(chuàng)面微環(huán)境，改善微循環(huán)，對創(chuàng)面愈合無疑是必要和有效的[4-5]。近年來自噬誘導對內皮細胞收縮功能的調控逐漸得到認可[6]。紫色疽瘡膏是我們治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面的經驗方，本研究通過觀察紫色疽瘡膏對內皮細胞自噬作用的影響，探討其治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面的作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷標準 糖尿病足慢性創(chuàng)面的診斷參照《國際糖尿病足工作組糖尿病足慢性創(chuàng)面處理指南》中的相關診斷標準[7]，糖尿病足潰瘍病程>4周不能愈合，且也無明顯愈合趨勢。局部血瘀證參照《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》中辨證標準[8]：創(chuàng)面潰爛經久，基底呈黯紅色或紫黯色，滲出物較少或干枯無膿，腐肉少許或腐肉雖脫，但新肉難生，創(chuàng)周膚色黯無紅腫。

1.1.2 納入標準 符合上述診斷標準；糖尿病足Wagner分級[7]2～3級，創(chuàng)面面積4～10 cm2；患者簽屬知情同意書，并自愿參加本研究，經過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.3 排除標準 排除放射性、結核性及癌性創(chuàng)面；排除由于動脈粥樣硬化閉塞癥導致的創(chuàng)面潰瘍者；合并有惡性腫瘤、急性心腦血管意外、腎功能不全、嚴重肝臟損傷等疾病者。

1.2 一般資料 共納入5例患者，男3例，女2例，年齡44～73歲，糖尿病病程5～21年，糖尿病足病程4個月～6年。

1.3 治療方法 單純采用紫色疽瘡膏(以龍血竭為主藥，還包括輕粉、紅粉、琥珀粉、乳香粉、冰片、煅珍珠粉，由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室加工成膏劑)外敷治療，每日1次。

1.4 皮膚標本選擇及保存 5例患者分別在治療前及治療3、6 d后局部蠶食清創(chuàng)換藥時留取適量創(chuàng)面組織標本，作為治療組。另選取肢體近端正常皮膚真皮淺層組織，作為正常對照組。2組組織分為2部分，一部分立即置于-80 ℃冰箱保存，其余放入10%中性福爾馬林溶液中保存，進行脫水、固定、石蠟包埋。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 微血管內徑 對皮膚真皮淺層微血管內皮細胞進行CD34免疫組織化學染色和免疫熒光四重染色[包括CD68、CD34、增殖細胞核抗原(PCNA)及α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)]，觀察皮膚真皮淺層微血管內徑變化情況。取上述石蠟包埋組織，切片后進行CD34免疫組織化學染色，再用日本Olympus公司CX41-12C02型光學顯微鏡進行觀察，CD34免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，嚴格按照試劑盒說明操作。取-80 ℃冰箱保存組織，按文獻[9-10]中的方法進行免疫熒光四重染色，再用日本Olympus公司CX31-32RFL型熒光顯微鏡進行觀察，其中TSA plus免疫熒光試劑盒、一抗、二抗及熒光素均由美國PerkinElmer公司提供，小鼠抗人CD68、CD34、PCNA及αSMA抗體由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明操作。均采用德國Carl Zeiss公司ZEN顯微圖像分析系統(tǒng)觀察及測量微血管內徑。

1.5.2 細胞自噬 采用免疫組織化學染色法對膜型微管相關蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)染色觀察。取上述石蠟包埋組織，切片后進行LC3Ⅱ免疫組織化學染色，常規(guī)光學顯微鏡觀察完畢后換用高倍油鏡觀察，LC3Ⅱ免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，嚴格按照試劑盒說明操作。采用蛋白質免疫印跡法對創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ/胞漿型微管相關蛋白1輕鏈3(LC3Ⅰ)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白含量進行測定，采用美國Thermo Fisher Scientific公司MultiSkan MK3酶標儀進行檢測和拍照，相關試劑盒購自天津銳爾康生物科技有限公司，計算靶蛋白的積分光密度值，并與β-actin內參蛋白進行比較，計算靶蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 2組皮膚真皮淺層微血管內徑比較 見表1、圖1。

表1 2組皮膚真皮淺層微血管內徑比較

注：A～D為免疫組織化學染色；E～H為免疫熒光四重染色，其中紅色為CD68+細胞，綠色為CD34+細胞，藍色為PCNA+細胞，紫紅色為αSMA+細胞

由表1、圖1可見，免疫組織化學染色和免疫熒光四重染色結果均顯示，與正常對照組比較，治療組治療前皮膚真皮淺層微血管內徑明顯增大，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與治療組治療前比較，治療組治療3、6 d后皮膚真皮淺層微血管內徑均明顯縮小，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組治療3 d后與治療6 d后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 2組創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、eNOS及p-mTOR蛋白表達水平比較 見表2、圖2。

表2 2組創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、eNOS及p-mTOR蛋白表達水平比較

注：1正常對照組；2治療組治療前；3治療組治療3 d后；4治療組治療6 d后

由表2、圖2可見，與正常對照組比較，治療組治療前創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平明顯降低，eNOS蛋白表達水平明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與治療組治療前比較，治療組治療3、6 d后創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平明顯升高，eNOS蛋白表達水平明顯降低，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組治療3 d后與治療6 d后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 2組LC3Ⅱ免疫組織化學染色結果 在低倍光鏡下觀察，治療組治療前及正常對照組皮膚真皮淺層微血管內皮細胞LC3Ⅱ均呈現(xiàn)藍染，并且正常對照組藍染較深，治療組藍染較淡。治療組經紫色疽瘡方治療后3、6 d后染色有所增加，但淺于正常對照組。在高倍油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，2組LC3Ⅱ為藍染的顆粒狀，較集中于細胞核部及周圍，并向外呈輻射狀排列，呈細小的顆粒狀[11]。正常對照組LC3Ⅱ藍染顆粒較多且顏色較深，治療組治療前LC3Ⅱ藍染顆粒少且顏色較淺，而經紫色疽瘡方治療后3、6 d后LC3Ⅱ藍染顆粒有所增加，顏色加深。見圖3。

注：A～D為光鏡×200觀察結果；E～H為油鏡×1000倍觀察結果；I～L為油鏡局部放大圖

3 討論

創(chuàng)面的修復是一個復雜過程，主要包括炎癥期、增殖期及組織重塑期3個階段，任何一個階段出現(xiàn)異常都可導致創(chuàng)面的修復異常，其中過度炎性反應導致的血管生成紊亂、微血管功能障礙、上皮化異常等是創(chuàng)面難愈合的主要原因[12]。自噬是細胞內的降解系統(tǒng),自噬小泡可以包裹衰老或受損的細胞器,將其運輸至溶酶體進行消化，降解的物質可再循環(huán)利用，并可通過多種途徑調整細胞功能，對維持內皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞穩(wěn)態(tài)及創(chuàng)面修復具有重要作用[13]。近年來，自噬在慢性創(chuàng)面內皮細胞功能調節(jié)中的作用逐漸得到重視。研究表明，糖尿病足潰瘍瘡面中內皮細胞自噬水平明顯低于未潰皮膚中內皮細胞自噬水平，瘡面中的自噬被明顯抑制[14]。LC3是自噬過程的標志物，主要參與了自噬小體的形成，自噬發(fā)生時LC3前體分子首先裂解形成胞質形式的LC3Ⅰ，然后再降解以膜結合形式的LC3Ⅱ附著到自噬體膜上，LC3Ⅰ與LC3Ⅱ存在一個生成與降解的動態(tài)過程，因此臨床通常以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值評估自噬水平的高低[14]。自噬的激活過程受多種基因和信號通路的調控，mTOR作為細胞內中心信號調節(jié)因子，可接受激素、能量、營養(yǎng)、氧化應激、生長因子等多種信號的刺激，對細胞自噬的大多數(shù)信號傳導通路呈負性調控。mTOR可抑制自噬起始分子ULK1的活性，從而實現(xiàn)對自噬的調控，但當其磷酸化為p-mTOR后，可解除對ULK1的抑制，從而誘導細胞自噬產生系列的生理活動[15]。一氧化氮(NO)是調節(jié)內皮細胞舒縮的主要物質，其合成酶主要為一氧化氮合酶(NOS)，eNOS就是存在于內皮細胞中的NOS，當其激活時eNOS利用L-精氨酸和氧產生NO從而舒張血管，使血管內徑增加[16]，而自噬可以調控eNOS水平，從而調控血管的舒縮，也是調節(jié)舒縮功能的主要途徑[17]。本研究結果顯示，治療組治療前LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白水平較正常對照組明顯降低(P<0.05)，也說明了內皮細胞自噬水平受到抑制，eNOS水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)，進而也導致了皮膚真皮淺層微血管內徑較正常對照組明顯增加(P<0.05)。但另有研究認為，誘導自噬后可使eNOS表達增加，而自噬水平降低伴隨著eNOS表達的下調[18]，與本研究結果相左，其原因不明，可能與本研究所選的均為血瘀型慢性創(chuàng)面有關，其具體原因需要進一步研究。

糖尿病足慢性創(chuàng)面的愈合問題一直是臨床治療的難點，中醫(yī)學認為其發(fā)生與氣、血關系密切，機體氣虛和局部血瘀是導致創(chuàng)面遷延難愈的根本原因[19-20]。糖尿病足病程日久，創(chuàng)面長期難以愈合或反復發(fā)作，耗傷人體氣血，氣虛則行血無力，血虛則不能滋養(yǎng)筋骨四肢，造成血流遲緩，經脈失養(yǎng)，氣血瘀滯，血脈擴張，久郁化熱，熱瘀結合，蘊結肌膚，腐蝕筋肉進而導致創(chuàng)面難愈。紫色疽瘡膏是我們臨床治療糖尿病足血瘀型慢性瘡面的經驗方[21]，方中重用龍血竭活血定痛，化瘀止血，斂瘡生??；琥珀粉、乳香粉增強化瘀之力；紅粉、輕粉味辛，可拔毒提膿，祛腐生肌；冰片辛寒，通諸竅，散郁火，消腫止痛，增加通散之功；珍珠粉解毒生肌，斂瘡止癢。諸藥合用，以活血化瘀為重點，佐以解毒斂瘡、祛腐生肌，則絡通、瘀散、腐去、肉生。現(xiàn)代藥理學研究表明，龍血竭中主要成分龍血素A、龍血素B具有促進大鼠急性皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，能通過參與調控P物質和Bcl-2的表達,增加細胞增殖和減少細胞凋亡，有效地促進糖尿病燙傷創(chuàng)面的愈合，此外龍血竭還有抗菌、抗炎、降血糖、降血脂、抗腫瘤等功效[22-24]。本研究結果顯示，治療組治療3、6 d后創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平較治療前明顯升高(P<0.05)，eNOS蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，皮膚真皮淺層微血管內徑明顯縮小(P<0.05)。

綜上所述，紫色疽瘡膏治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面療效確切，其作用機制可能與增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平，降低eNOS蛋白表達水平，提高內皮細胞自噬水平有關，可改善血管內皮細胞的舒縮功能，改善創(chuàng)面局部血管擴張淤滯狀態(tài)，改變局部微環(huán)境，促進血液循環(huán)，促進新陳代謝，進而促進創(chuàng)面的生長和修復。然而創(chuàng)面修復畢竟是一個十分復雜的過程，中藥也具有多重的生物功效，紫色疽瘡膏對其治療是否還存在其他的作用途徑，有待將來進一步觀察研究。