羅家偉，張國偉，康麗華，管懷進

0引言

外泌體(exosomes)是一類直徑50～150nm的細胞外囊泡，主要起源于細胞質內的多泡小體(multivesicular bodies，MVBs)[1]。外泌體的分泌受神經酰胺[2]、鈣離子濃度[3]、Rab蛋白[4]等多因素調控。外泌體攜有蛋白質、脂質、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)、微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)和脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)等多種生物活性分子，并能轉運至靶細胞中，調控靶細胞的功能[5]。外泌體與多種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展相關，本文總結了外泌體在角膜損傷、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、年齡相關性白內障(age-related cataract，ARC)、青光眼、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)及葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)中的研究進展。

1外泌體概述

1.1外泌體的起源細胞內組分可通過依賴轉運必需內體分選復合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)的途徑與不依賴ESCRT的途徑被特異性地轉運進細胞內體中[5]，形成含有許多管腔內膜泡(intraluminal vesicles，ILVs)的內體，即MVBs。當MVBs膜與細胞膜融合時，這些ILVs被釋放到細胞外，即為外泌體[6]。

1.2外泌體的提取方法針對外泌體的密度、尺寸和表面抗原等特征，有多種提取外泌體的方法，如梯度超速離心法、聚乙烯二醇共沉淀法、密度梯度超速離心法、尺寸排阻色譜法、免疫捕獲法等[7]。上述方法在外泌體的得率和純度上各不相同。針對不同的實驗目的和樣本類型，需選擇適當?shù)奶崛》椒ā?/p>

1.3外泌體的特征大部分外泌體共同攜帶的蛋白[8]包括四跨膜蛋白超家族(如CD63、CD9、CD81)、熱休克蛋白家族(如熱休克蛋白70、熱激同源蛋白70)、ESCRT相關蛋白(如Alix、TSG101)，上述蛋白常被選作鑒定外泌體的特異性標志物。透射電子顯微鏡可觀察到外泌體呈直徑50～150nm，且周邊隆起中央凹陷的圓形“茶托樣”形態(tài)[9]。納米粒子追蹤分析技術常用于分析樣品中外泌體的尺寸分布和密度[9]。

2外泌體與眼科疾病

外泌體可在淚液[10]、房水[11]、玻璃體液[12]和血液[13]等眼部體液中穩(wěn)定存在，在調節(jié)眼部細胞遷移[14]、增生、凋亡[15]、免疫反應[16]和血管生成[17]等方面發(fā)揮重要作用。外泌體與角膜損傷、DR、ARC、青光眼、ARMD及UM等眼病關系密切。

2.1外泌體與角膜損傷角膜的透明和完整對視力至關重要。角膜損傷后，需要及時愈合以預防眼內感染。角膜愈合涉及凋亡、增殖、分化、遷移和細胞外基質重塑等多個生物學過程[18]。新生血管形成是角膜愈合中常見的并發(fā)癥?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族是一類促血管生成因子。MMP-14和MMP-2可重塑血管內皮細胞外基質，促進新生血管生長[19-20]。血管內皮生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)作為誘餌受體競爭性結合血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，負調節(jié)其促血管生成作用[21]。MMP-14可降解細胞表面的VEGFR1，從而解除對VEGFA的抑制，促進血管內皮細胞增殖和遷移，誘導血管形成[14]。角膜成纖維細胞可通過外泌體將MMP-14遞送至血管內皮細胞，以促進角膜新生血管的生成[22]。除了角膜成纖維細胞外泌體，角膜上皮細胞外泌體也參與調控角膜愈合。Han等[23]使用透射電鏡在大鼠角膜損傷模型的角膜上皮細胞表面和角膜基質中觀察到外泌體。小鼠角膜上皮細胞的外泌體可促進小鼠角膜成纖維細胞的增殖和分化，同時能促進人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖[23]。Zieske等[24]在體外構建了兔角膜后彈力層(含角膜內皮細胞)與角膜成纖維細胞三維共培養(yǎng)模型，并在后彈力層基質中與角膜成纖維細胞表面觀察到外泌體。提示在角膜外傷愈合過程中角膜成纖維細胞、角膜內皮細胞、角膜血管之間存在潛在的外泌體介導的跨細胞通訊方式，但機制及意義尚未完全闡明。

間充質干細胞衍生的外泌體也可調控角膜愈合。Shen等[25]報道，脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC)分泌的外泌體可促進角膜基質細胞的增殖、抑制其凋亡，且促進角膜基質細胞轉化為角膜成纖維細胞。ADSC來源的外泌體還可抑制角膜基質細胞中MMP的表達，誘導細胞外基質相關蛋白(如膠原蛋白、纖維連接蛋白等)的表達，促進細胞外基質的合成以抑制新生血管。Tao等[26]使用人胎盤來源間充質干細胞(human placenta-derived MSCs，hP-MSCs)分泌的外泌體孵育小鼠角膜堿燒傷傷口，發(fā)現(xiàn)hP-MSCs外泌體處理組角膜新生血管較對照組(PBS處理組)少，且透明性也優(yōu)于對照組，角膜中促血管生成相關基因與炎癥因子基因表達亦顯著降低。Shojaati等[27]報道人角膜基質來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells from corneal stromal stem cells，CSSC)分泌的外泌體也可抑制小鼠角膜傷口的瘢痕形成并維持角膜透明性，且發(fā)現(xiàn)CSSC外泌體的保護作用可能是通過遞送miRNA實現(xiàn)的[27]。上述結果均揭示了間充質干細胞外泌體對角膜愈合的保護性作用，但具體機制及臨床應用價值仍有待研究。

2.2外泌體與糖尿病視網膜病變DR的基本病理為視網膜微血管病變，最終形成視網膜新生血管[28]。新生血管的形成與視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)通透性有關。病理狀態(tài)的RPE通透性增加，未成熟的脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)可穿透RPE生長到視網膜中，導致視力損害。

視網膜毛細血管主要由血管周細胞與內皮細胞組成。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠視網膜血管周細胞內環(huán)狀RNA-cPWWP2A(circular RNA cPWWP2A，circRNA-cPWWP2A)表達上調，而在血管內皮細胞中表達無變化。血管周細胞中高表達的circRNA-cPWWP2A可抑制細胞凋亡，并通過外泌體以旁分泌的形式傳遞給血管內皮細胞。在內皮細胞中，circRNA-cPWWP2A作為分子海綿吸附miR-579，誘導血管生成素1、緊密連接蛋白、沉默信息調節(jié)因子1表達上調，增強血管內皮細胞的增殖、遷移和成管能力。外泌體circRNA-cPWWP2A介導的血管周細胞-內皮細胞跨細胞調控可能是視網膜毛細血管在高糖環(huán)境下對抗損傷和滲漏的代償機制，但高糖環(huán)境誘導circRNA-cPWWP2A上調的機制依然不明。

除了血管周細胞外泌體，視網膜星形膠質細胞外泌體也在DR中發(fā)揮保護作用。在激光誘導的小鼠CNV模型中，視網膜星形膠質細胞分泌的外泌體可抑制巨噬細胞的遷移和血管內皮細胞成管功能，減輕視網膜血管炎癥和滲漏[17]。在視網膜星形膠質細胞外泌體中發(fā)現(xiàn)有12種抗血管生成因子(如內皮他丁)表達。抑制視網膜星形膠質細胞的內皮他丁表達后，其分泌的外泌體的抗視網膜血管滲漏作用消失[17]。提示視網膜星形膠質細胞外泌體可能是通過遞送抗血管生成因子來發(fā)揮保護作用的。

血-視網膜屏障的完整對避免DR中的視網膜血管滲漏至關重要。視網膜內皮細胞是組成血-視網膜屏障的重要部分。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠血漿中血小板衍生的外泌體顯著增加，且血小板外泌體中CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)也顯著上調。糖尿病大鼠的血小板外泌體可向視網膜內皮細胞遞送CXCL10激活TLR4信號通路，抑制超氧化物歧化酶活性，誘導活性氧產生和氧化損傷，破壞血-視網膜屏障。而體外構建的高表達miR-126的人間充質干細胞外泌體，可向視網膜內皮細胞傳遞miR-126抑制高遷移率族蛋白B1信號通路，減輕高血糖誘導的視網膜炎癥[31]。上述研究結果為DR治療提供了新思路。

過氧化物酶體增殖子激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ)是一種促血管生成因子，它可誘導血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)上調，刺激新生血管形成。在增殖性DR患者的房水、玻璃體液和增殖膜中PPARγ表達上調，且表達量與視網膜纖維增生程度正相關[12]。HUVECs分泌的外泌體也含有PPARγ。提示PPARγ可能由血管內皮細胞經外泌體釋放到房水和玻璃體液中，調控新生血管生成。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)具有抗血管生成作用[32]。RPE細胞可定向地從頂端區(qū)分泌攜帶PEDF的外泌體，而基底側幾乎不分泌[33]。提示RPE衍生的外泌體可能在DR中發(fā)揮抗新生血管作用，但具體機制依舊不明。

2.3外泌體與年齡相關性白內障ARC是全球首位致盲性眼病，表觀遺傳調控是ARC重要的影響因素。miRNA在ARC患者與晶狀體透明的正常對照者所捐獻眼球的晶狀體上皮細胞中差異表達[34-35]，通過調控晶狀體上皮細胞靶基因參與ARC的病程[36]。Dismuke等[11]從ARC患者房水外泌體中檢測出多種miRNA，推測房水外泌體可能通過遞送miRNA調控晶狀體靶基因，影響ARC的病程。但出于倫理原因Dismuke等未檢測正常人的房水外泌體，因此無法證明在ARC患者與正常人房水中外泌體miRNA的差異表達。Chen等[37]檢測了合并高度近視與未合并高度近視的ARC患者房水中外泌體miRNA表達譜，但也不能反映ARC患者與正常人房水外泌體miRNA的表達差異。因此房水外泌體miRNA在ARC中的意義仍不清楚。

2.4 外泌體與青光眼青光眼作為全球第二位致盲性眼病，病理性高眼壓是其主要危險因素。根據(jù)前房角形態(tài)及病因可分為原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)和原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)。POAG與小梁網細胞外基質重塑導致的房水流出通道受阻有關[38]。前文提到外泌體可攜帶MMP[22]，提示外泌體可能參與POAG的細胞外基質重塑。Han等[39]報道，POAG的發(fā)病與小梁網細胞的侵襲小體有關。侵襲小體是一種細胞膜偽足，表面含多種蛋白水解酶，參與降解細胞外基質。Hoshino等[40]報道，在侵襲小體形成過程中，特定的外泌體亞群被轉運到侵襲小體內，當抑制外泌體相關基因后，可阻斷侵襲小體形成及細胞外基質降解。Sung等[41]發(fā)現(xiàn)細胞遷移也依賴外泌體的釋放。提示外泌體可能調控小梁網細胞的遷移、侵襲和細胞外基質重塑，但參與POAG發(fā)病的機制仍不明了。

MYOC基因是POAG重要的致病基因，在小梁網及睫狀肌中高表達[42]。MYOC基因編碼myocilin蛋白，可調控小梁網細胞外基質沉積[43]、小梁網細胞形態(tài)[44]、睫狀肌細胞外基質重塑[45]，是調節(jié)房水流出阻力的重要因子。房水中含myocilin蛋白，且主要存在于外泌體中[46]。小梁網細胞與睫狀肌細胞可通過房水外泌體實現(xiàn)信息交流[47]。Stamer等[48]發(fā)現(xiàn)來源于房水和小梁網細胞株的外泌體中都有myocilin蛋白。地塞米松可誘導人小梁網細胞株分泌的外泌體中myocilin蛋白顯著增加。提示小梁網細胞外泌體myocilin在POAG和糖皮質激素相關性青光眼中具有潛在作用。

青光眼還與眼部炎癥有關[49]。人色素上皮細胞系19(adult retinal pigment epithelial cell line-19，ARPE-19)受白細胞介素1B刺激后，其分泌的外泌體可誘導單核細胞分泌多種炎癥因子(如白細胞介素6、白細胞介素8、腫瘤壞死因子α等)，并促進單核細胞凋亡[16]。炎癥因子誘導的ARPE-19外泌體亦可抑制T細胞增殖。提示RPE細胞外泌體可能參與減輕青光眼相關炎癥反應。

青光眼病程中的高眼壓會誘發(fā)視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡，造成不可逆的視力損害。間充質干細胞外泌體不僅在角膜損傷中[26]，也在RGCs損傷中發(fā)揮保護作用。骨髓間充質干細胞分泌的外泌體可向受損的RGCs運輸腦源性神經營養(yǎng)因子、神經生長因子和血小板源性生長因子，促進RGCs的存活和再生[50]。間充質干細胞外泌體對RGCs的保護作用為治療青光眼并發(fā)癥提供了新思路。

2.5外泌體與年齡相關性黃斑變性ARMD表現(xiàn)為RPE、Bruch膜和脈絡膜毛細血管的退行性病變[51]。局部慢性炎癥和補體旁路途徑失衡是ARMD的病理基礎[52]。當RPE細胞氧化應激時，外泌體可帶走RPE細胞表面的免疫調節(jié)因子(如CD46、CD55、CD59等)，使RPE細胞表面缺乏免疫調節(jié)因子而更易受到補體攻擊[53]。提示RPE外泌體可能參與ARMD相關的補體免疫。

Bruch膜是脈絡膜與RPE之間的屏障。ARMD患者的RPE功能失調導致Bruch膜發(fā)生破壞，脈絡膜毛細血管易穿透Bruch膜生長到視網膜形成CNV，一旦累及黃斑區(qū)，會導致嚴重的視力損傷。Xu等[15]報道，人臍帶胚胎干細胞分泌的外泌體可抑制缺氧RPE細胞的遷移與凋亡，為治療ARMD提供了新思路。在ARMD早期，隨著RPE的功能失調，黃斑區(qū)出現(xiàn)Bruch膜變薄和RPE下脂質與蛋白沉積，形成軟性玻璃疣[51]。在ARMD患者的視網膜玻璃疣中有外泌體標志物CD63，且與玻璃疣相關淀粉樣蛋白存在共定位[54]。體外研究發(fā)現(xiàn)，RPE細胞氧化損傷后溶酶體功能失調，胞吐作用增強[54]。提示RPE細胞外泌體可能參與構成ARMD患者視網膜玻璃疣。此外，細胞外基質重塑與玻璃疣及新生血管密切相關[55]。RPE細胞會定向地從基底側分泌含解整合素樣金屬蛋白酶10(a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10)的外泌體[33]。ADAM家族被發(fā)現(xiàn)參與細胞外基質重塑[56]。提示RPE細胞外泌體可能參與調控ARMD中的細胞外基質重塑。

為探索外泌體對ARMD的診斷價值。Kang等[57]從ARMD患者的房水中提取到外泌體，發(fā)現(xiàn)與單純ARC患者相比，ARMD患者房水外泌體中組織蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)上調。接受抗VEGF單克隆抗體治療后，患者房水外泌體中CTSD降低。在ARPE-19體外損傷模型的外泌體中也檢測到CTSD上調。Voisin等[58]發(fā)現(xiàn)在ARMD患者和對照者(眼底檢查正常，無視網膜玻璃疣或色素變性，且無ARMD家族史)提取的RPE多能干細胞中，ARMD組的CTSD表達量更高。提示房水中的外泌體CTSD可作為判斷ARMD進展的標志物。Klingeborn等[13]使用免疫親和捕獲法(以CD81作為抗原靶點)提取并比較了ARPE-19上清外泌體、人血漿外泌體、原代培養(yǎng)的豬RPE細胞頂端分泌的外泌體的蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體與ARPE-19細胞外泌體蛋白表達譜有顯著差異，且在血漿外泌體中未發(fā)現(xiàn)RPE細胞特異性的蛋白。由于尚未發(fā)現(xiàn)ARMD的血漿外泌體生物標志物，仍需尋找更具RPE細胞特異性的外泌體免疫捕獲靶點。

2.6外泌體與葡萄膜黑色素瘤UM是成年人最常見的眼內惡性腫瘤。外泌體可激活免疫系統(tǒng)調控UM的轉移。非轉移性UM可分泌外泌體至腫瘤細胞轉移前微環(huán)境，遞送PEDF激活單核細胞，并招募自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)至腫瘤細胞轉移前微環(huán)境。同時誘導巨噬細胞極化，并上調其腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的表達。NK細胞和巨噬細胞均參與清除UM細胞，從而抑制非轉移性UM的遠處轉移[32]。而轉移性UM分泌至腫瘤細胞轉移前微環(huán)境的外泌體缺乏PEDF，卻攜帶有間質上皮轉化因子[59]，能誘導血管滲漏和新生血管形成，促進UM轉移與生長。此外，Ragusa等[60]發(fā)現(xiàn)在UM患者玻璃體液中的外泌體miR-146a比對照者(正常健康眼球捐獻者)上調，且UM患者的血清外泌體中miR-146a同樣相對正常健康對照者升高。提示血清外泌體miR-146a有望成為UM診斷的潛在標志物。

3總結和展望

作為一種普遍存在的跨細胞通訊方式，外泌體具有在細胞間傳遞生物活性分子調控靶細胞的功能。在免疫、退行性疾病、腫瘤、血管生成等各個領域，外泌體已成為研究熱點。近年來，雖然在眼科疾病相關領域外泌體研究取得了一些進展，但仍相對處于起步階段。外泌體研究技術的進步及眼科交叉領域的外泌體研究進展，勢必會對眼科外泌體研究起到極大的推動作用。隨著對外泌體在眼科疾病發(fā)生發(fā)展中作用的認識不斷深入，外泌體有望成為眼病治療的新興靶點，也為眼病的診斷與預后提供了新思路。