裴小瑜，李少芳，劉凱

(三二○一醫(yī)院新生兒科，陜西 漢中 723000)

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing entero-colitis，NEC)是臨床常見的小腸、結(jié)腸彌漫性壞死性的危重疾病，好發(fā)于早產(chǎn)兒，嚴重者可導(dǎo)致死亡[1-2]。目前NEC的發(fā)病機制尚不明確，可能與腸道菌群紊亂、機體免疫等有關(guān)[3]，臨床多通過炎癥指標、影像學(xué)指標、尿液指標等[4-6]對NEC進行監(jiān)測與預(yù)后判斷，單一或聯(lián)合檢測的判斷價值均良好，可為制訂臨床治療方案以及治療藥物選擇提供參考，但此類指標往往忽略了腸道菌群在疾病進展中的作用。采用基因組學(xué)、代謝組學(xué)等方法測定NEC患兒腸道菌群變化，可判斷NEC患兒腸道菌群各菌屬情況，但操作難度大、費用高、周期長，難以在基層醫(yī)院實施。因此，急需尋找合適、簡便易行的腸道菌群監(jiān)測指標。糞便自誘導(dǎo)分子-2(autoinducer-2，AI-2)是機體腸道菌群的信號因子，與腸道菌群的穩(wěn)定性、正常菌群定植以及胃腸道感染性疾病有關(guān)[7]。糞便人β-防御素(human β-defensin，HBD)是一類由胃腸道黏膜分泌的抗菌肽，主要分為HBD1、HBD2，與機體免疫功能和胃腸道炎癥因子變化密切相關(guān)[8]。本研究旨在探討AI-2、HBD在NEC中的水平及其對該病的監(jiān)測價值，以彌補臨床對NEC患者腸道菌群影響因子監(jiān)測的不足。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2020年1月三二○一醫(yī)院新生兒科收治的33例確診NEC早產(chǎn)兒作為NEC組，其中NEC診斷時定為急性期，再次開奶 3 d后定為恢復(fù)期。NEC組中男18例、女15例；胎齡30～36周，平均(33.0±2.1)周；出生體重1 892～2 637 g，平均(2 355±218) g；Apgar評分6～8分，平均(7.5±1.1)分；入組日齡1～23 d，平均(7.3±1.0) d。選取同期41例早產(chǎn)非NEC患兒作為非NEC組，其中男23例、女18例；胎齡30～36周，平均(33.1±2.0)周；出生體重1 783～2 688 g，平均(2 369±213) g；Apgar評分6～9分，平均(7.4±1.1)分；入組日齡1～20 d，平均(7.4±1.1) d；新生兒病理性黃疸32例，新生兒肺炎9例。兩組性別、胎齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過三二○一醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準：①符合《兒科學(xué)(第8版)》[9]、《諸福棠實用兒科學(xué)(第7版)》[10]關(guān)于早產(chǎn)兒、NEC的診斷標準；②產(chǎn)婦既往無特殊病史；③單胎，頭位；④入組日齡≤28 d；⑤糞便量足夠(滿足AI-2、HBD檢測要求)；⑥臨床資料完整；⑦非NEC組無消化道癥狀；⑧依從性良好。排除標準：①全身嚴重感染；②消化道畸形；③先天性心臟??；④免疫缺陷性疾?。虎菪墓δ懿蝗?；⑥呼吸衰竭；⑦轉(zhuǎn)院、轉(zhuǎn)科、中途家屬要求退出試驗。

1.3方法 所有NEC患兒于診斷NEC當天和臨床癥狀好轉(zhuǎn)并開奶3 d時采集3～5 g糞便，置于-80 ℃保存。非NEC患兒于出院時采集3～5 g糞便，置于-80 ℃保存。取250 mg糞便溶于按1∶50配備的尿素和檸檬酸鹽緩沖液中，采用漩渦振蕩器(日本日立公司生產(chǎn)，型號：HM-2N)震蕩30 s，采用離心機(北京奧德瑞泰科技有限公司生產(chǎn)，型號：MHY-13389)以13 000×g離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定糞便中HBD1、HBD2水平。另取40 mg糞便標本混合于2216E液體培養(yǎng)基(青島高科因海博生物生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號：HB0132-1，規(guī)格：250 g)，漩渦震蕩30 s后以2 300×g離心10 min，過濾后作為待測樣本。

以1 μmol AI-2作為陰性對照，采用生物熒光檢測法測定糞便中AI-2水平。采集0.2 g糞便樣本用于提取微生物DNA，采用338F(5′-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)及806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行16S核糖體DNA的V3和V4區(qū)域的聚合酶鏈反應(yīng)擴增，然后通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離以及AxyPrepDNA凝膠回收得到聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。采用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測，并通過Illumina Miseq平臺建庫測序。對原始數(shù)據(jù)優(yōu)化后采用Usearch 7.0進行操作分類單元劃分，得到綱水平、種屬水平腸道菌群情況，并根據(jù)Chaol算法計算香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Weiner指數(shù))，Shannon-Weiner指數(shù)越高，表明生物多樣性越高[11]。

另采集3～5 g糞便送至三二○一醫(yī)院臨床檢驗中心，根據(jù)《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》[12]將糞便菌群紊亂情況分為以下4個等級。①基本正常：糞便標本細菌總數(shù)處于正常值范圍，革蘭陽性菌數(shù)大于革蘭陰性菌數(shù)，革蘭陽性或陰性球菌少見；②Ⅰ度失調(diào)：糞便標本細菌總數(shù)略低于正常值，革蘭陽性菌數(shù)小于革蘭陰性菌數(shù)，革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌增多；③Ⅱ度失調(diào)：糞便標本細菌總數(shù)明顯低于正常值，革蘭陰性桿菌總數(shù)增多，革蘭陽性球菌數(shù)目較多，有少量酵母樣菌；④Ⅲ度失調(diào)：糞便標本細菌總數(shù)極少，未見或很少見革蘭陽性或陰性桿菌，酵母樣菌比例較多。

2 結(jié) 果

本研究病例經(jīng)對癥支持治療后均康復(fù)出院，無死亡病例。

2.1兩組腸道菌群紊亂分級比較 NEC組腸道菌群紊亂發(fā)生率高于非NEC組[81.82%(27/33)比41.46(17/41)](χ2=12.352，P<0.001)，NEC組腸道菌群紊亂分級優(yōu)于非NEC組[Z=-3.366,P=0.001]，見表1。

表1 NEC組與非NEC組患兒腸道菌群紊亂分級比較 (例)

2.2非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組腸道菌群綱水平和種屬水平Shannon-Weiner指數(shù)比較 各組腸道菌群綱水平和種屬水平Shannon-Weiner指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NEC恢復(fù)期組綱水平和種屬水平Shannon-Weiner指數(shù)低于非NEC組和NEC急性期組(P<0.05)，NEC急性期組與非NEC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組腸道菌群綱水平和種屬水平Shannon-Weiner指數(shù)比較

2.3非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組前三位綱水平腸道菌群的相對豐度比較 各組變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NEC急性期組變形菌門、厚壁菌門相對豐度高于非NEC組，而擬桿菌門相對豐度低于非NEC組(P<0.05)；NEC恢復(fù)期組變形菌門、擬桿菌門相對豐度均低于非NEC組和NEC急性期組，而厚壁菌門相對豐度高于非NEC組(P<0.05)，見表3。

表3 非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組前三位綱水平腸道菌群的相對豐度比較

2.4非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組前三位種屬水平腸道菌群的相對豐度比較 各組大腸埃希菌-志賀菌屬相對豐度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，克雷伯菌屬和腸桿菌屬比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NEC急性期組克雷伯菌屬相對豐度高于非NEC組，而腸桿菌屬相對豐度低于非NEC組(P<0.05)；NEC恢復(fù)期組克雷伯菌屬相對豐度低于NEC急性期組和非NEC組，而腸桿菌屬相對豐度高于NEC急性期組和非NEC組(P<0.05)，見表4。

表4 非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組前三位種屬水平腸道菌群的相對豐度比較

2.5非NEC組、NEC急性期和恢復(fù)期組糞便HBD、AI-2水平比較 各組HBD1、HBD2及AI-2水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NEC急性期組和NEC恢復(fù)期組HBD1、HBD2及AI-2水平均低于非NEC組(P<0.05)；NEC恢復(fù)期組均低于NEC急性期組(P<0.05)，見表5。

表5 非NEC組、NEC急性期組、NEC恢復(fù)期組糞便HBD1、HBD2、AI-2水平比較

3 討 論

NEC是臨床常見的、多種因素導(dǎo)致的兒科危重癥，嚴重威脅患兒生命安全。目前，對于NEC發(fā)病機制的研究主要集中在腸道菌群紊亂、機體免疫、新生兒感染、喂養(yǎng)成分、缺血性損傷等方面，特別是患兒機體免疫力及日常喂養(yǎng)成分對NEC患兒的治療和康復(fù)具有重要影響[13]。目前關(guān)于NEC患兒胃腸道菌群變化的研究較少，缺乏相關(guān)特異性指標，而早產(chǎn)兒因自身胃腸道發(fā)育極不成熟，更易發(fā)生NEC。Pammi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NEC患兒腸道菌群數(shù)量往往低于正常水平，同時產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、艱難梭菌等非益生菌異常增殖進一步加重了NEC患兒的腸道菌群紊亂。本研究中，NEC組腸道菌群紊亂發(fā)生率高于非NEC組(P<0.05)，表明NEC早產(chǎn)兒腸道菌群紊亂明顯，腸道微生態(tài)可能參與NEC的發(fā)生、發(fā)展，NEC患兒腸道免疫功能和菌群平衡被打破，患兒更易感染病原微生物，進而加重腸道局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致手術(shù)、死亡等不良轉(zhuǎn)歸。

Pammi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，新生兒腸道紊亂與NEC的發(fā)病情況密切相關(guān)，擬桿菌門/屬細菌的相對豐度變化對NEC疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定作用。本研究參照付春燕等[15]研究方法繼續(xù)予恢復(fù)期組患兒廣譜抗生素治療，通過分析早產(chǎn)兒腸道菌群的綱水平和種屬水平菌群相對豐度情況發(fā)現(xiàn)NEC患兒的腸道菌群紊亂，益生菌與有害菌相對豐度失衡，擬桿菌門相對豐度遠低于非NEC患兒，且綱水平和種屬水平的Shannon-Weiner指數(shù)也有所下降，提示NEC患兒腸道菌群紊亂，NEC使早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu)嚴重破壞。本研究進一步分析急性期和恢復(fù)期NEC患兒腸道菌群發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)期NEC患兒的腸道菌群仍明顯紊亂，益生菌與有害菌相對豐度仍存在明顯失衡，原因可能是恢復(fù)期廣譜抗生素治療導(dǎo)致NEC患兒腸道菌群多樣性較非NEC患兒降低，且變形菌門、大腸埃希菌-志賀菌屬、腸桿菌屬等異常增殖，但具體原因有待后續(xù)研究的探討。因此，可強化藥物及飲食對恢復(fù)期NEC患兒腸道菌群的調(diào)節(jié)，以增加NEC患兒腸道菌群多樣性，促進疾病的康復(fù)。

目前，HBD、AI-2等是臨床針對腸道菌群紊亂研究的熱點指標。HBD是一類小分子抗菌肽，與呼吸道、胃腸道感染等疾病密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，HBD能與多種病原微生物結(jié)合，起到殺傷作用，進而維持腸道菌群數(shù)量的穩(wěn)定[16]。另有研究表明，HBD能趨化巨噬細胞、單核細胞等多種免疫細胞，并借助Toll樣受體4等多種識別受體調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，進而改善腸道菌群紊亂，維持機體正常免疫功能[17-18]。AI-2是LuxS細菌基因編碼產(chǎn)生的特殊信號分子，與細菌毒力、正常菌群定植、腸壁細胞增殖分化等密切相關(guān)。Christiaen等[19]研究表明，糞便AI-2水平與腸壁細胞結(jié)合力呈負相關(guān)，故補充AI-2可促進腸壁細胞結(jié)合力的恢復(fù)。Sun等[20]研究表明，AI-2可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和細菌毒力，促進NEC患兒康復(fù)，因此HBD、AI-2水平變化可能提示NEC轉(zhuǎn)歸。本研究結(jié)果顯示，NEC急性期和恢復(fù)期的HBD1、HBD2、AI-2水平均低于非NEC組。甘馨[21]研究顯示，NEC患兒的腸黏膜功能隨疾病進展不斷減弱，機體分泌HBD1、HBD2、AI-2能力下降，腸道菌群紊亂明顯，臨床針對性治療可有效糾正腸道菌群紊亂，降低腸道炎癥反應(yīng)，使腸黏膜功能逐漸恢復(fù)，進而提高HBD1、HBD2、AI-2的分泌和釋放。分析其原因可能為急性期HBD、AI-2水平降低與NEC早產(chǎn)兒腸道免疫功能下降和腸道菌群紊亂有關(guān)，患兒更易感染病原微生物，導(dǎo)致腸道局部炎癥反應(yīng)所致的損害加重；NEC恢復(fù)期HBD、AI-2水平未見明顯恢復(fù)可能與NEC患兒治療期間服用廣譜類抗生素導(dǎo)致腸道菌群紊亂，影響HBD1、HBD2、AI-2釋放有關(guān)，具體機制有待深入探究。

綜上所述，NEC患兒AI-2及HBD的水平較低，AI-2及HBD可能成為監(jiān)測NEC病情的潛在指標。因此，臨床應(yīng)加強早產(chǎn)NEC患兒HBD1、HBD2、AI-2水平的監(jiān)測，及時糾正患兒臨床癥狀，強化營養(yǎng)干預(yù)，調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成，進而改善患兒預(yù)后。