馮婧 劉雨夢 劉嘉鵬 張曉鳳 傅亮 車宇娥 王謙 李姝玉 王欣

1.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 102401；2.廣東駿豐頻譜股份有限公司，廣東 廣州 510623

糖尿病是由于絕對或相對的胰島素生物活性降低或效應不足而導致的疾病，臨床上常表現(xiàn)為“三多一少”的癥狀，即多飲、多食、多尿及體重減輕。單次劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病模型是實驗研究中常用的大鼠模型之一，具有簡便、易操作的特點。超低頻電磁場處理水（簡稱頻譜水）是將普通飲用水經(jīng)過超低頻電磁場處理后，使其物理化學特性發(fā)生改變的一種特殊處理水，安全無毒且能改善機體微循環(huán)，提高機體免疫功能，并在提高抗氧化能力等方面有一定作用［1］。紅外頻譜照射具有改善局部微循環(huán)、抗感染，提高機體抗損傷、抗病能力以及促進組織修復等功能，可提高動物體內(nèi)抗氧化酶的活力，減少氧化應激產(chǎn)物，提高抗氧化能力。本實驗采用STZ 腹腔注射致大鼠糖尿病模型，通過對血糖、尿酸、肌酐等生化指標腎臟病理學改變進行觀察，探討紅外頻譜照射及頻譜水對STZ 所致大鼠糖尿病模型的治療作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8 周齡健康雄性SD 大鼠90 只，體重（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，恒溫（22～24℃），濕度45%～55%，自由覓食飲水，每日更換墊料。

1.2 實驗藥品與試劑 STZ、PBS 緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、HE 染色液、4%多聚甲醛、2.5%戊二醛等購于北京索萊寶科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片（格華止）購于中美上海施貴寶制藥有限公司；血清尿素氮、肌酐、尿酸檢測試劑盒購于南京建成生物科技有限公司；尿微量白蛋白ELISA 試劑盒購于江蘇科特生物技術有限公司；快速血糖檢測儀及血糖試紙購自美國Roche。

1.3 實驗儀器 駿豐頻譜治療保健儀和頻譜水治療儀由廣東駿豐頻譜股份有限公司提供。低溫高速離心機（德國，Eppendorf），全波段酶標儀（德國，Bio-tek），超低溫冰箱（日本，SANYO），全自動脫水機（德國，Leica），全自動包埋機（德國，Leica），全自動石蠟切片機（德國，Leica），全自動染色機（德國，Leica），全自動封片機（德國，Leica），熒光倒置顯微鏡（日本，Olympus），單道可調(diào)移液器（德國，Eppendorf）等。

1.4 動物分組與模型建立 90 只健康雄性SD 大鼠大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后按體質(zhì)量隨機分成正常對照組18 只，糖尿病模型組72 只。模型組動物禁食（不禁水）12h，一次性腹腔注射2% STZ 溶液50mg/kg（現(xiàn)用現(xiàn)配，取適量STZ，用0.1mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中配制，pH＝4.4），正常對照組腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，3 天后鼠尾靜脈取血，測隨機血糖，以隨機血糖≥16.7mmol/L 為造模成功，隨后按大鼠體質(zhì)量隨機分為模型組和各處理組，每組18 只，處理組包括外照組、頻譜水組、鹽酸二甲雙胍組（陽性藥對照組）。動物模型建立后，各組動物進行8 周如下處理：灌胃劑量0.5mL/100g 體質(zhì)量，正常組、模型組每日灌胃生理鹽水一次，鹽酸二甲雙胍組每日灌胃二甲雙胍一次（0.15g/kg），外照組大鼠進行每日紅外照射一次（照射條件為2 檔，30min，以下簡稱外照組），以上四組動物均可自由飲用普通水；頻譜水組大鼠每日自由飲用超低頻電磁場處理水（以下簡稱頻譜水組）。

1.5 方法及觀察指標

1.5.1 大鼠一般狀態(tài)觀察。觀察大鼠的精神狀態(tài)，包括體質(zhì)量、飲食、皮毛及活動情況等，每2 周稱量體質(zhì)量、檢測空腹血糖一次并記錄。每4 周留取24h 代謝尿?？崭寡侨〈笫笪膊垦獧z測，將大鼠尾部尖端用酒精棉簽消毒后，采血針扎破皮膚，用干凈棉簽擦去第1 滴血，用血糖試紙、血糖儀采集第2 滴血，讀取血糖值。

1.5.2 血清檢測尿素氮、肌酐、尿酸水平。第8 周末，每組取8 只大鼠，大鼠禁食不禁水12h，檢測空腹血糖數(shù)值后，用10%的水合氯醛，按照3mL/kg 劑量腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血5mL，將血液垂直靜置2h 后，放置于4℃的離心機中，3000r/min，離心15min，取上層血清分裝于凍存管中，-80℃保存。使用血清尿素氮、肌酐、尿酸檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明，分別檢測上述指標血清含量水平。

1.5.3 Elisa 法檢測24h 尿微量白蛋白水平。分別于第4 周末、第8 周末取8 只大鼠24h 代謝尿，使用大鼠尿微量白蛋白Elisa 檢測試劑盒，嚴格按照要求分別檢測上述指標血清含量水平。

1.5.4 腎組織病理學觀察。第8 周末，各組動物麻醉后，無菌摘取腎臟。取適量腎組織經(jīng)10%甲醛固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，制成3μm 的石蠟切片，進行HE 染色并進行光鏡觀察。取小于1mm3的腎組織，2.5%的戊二醛固定1～2h 后，至4℃環(huán)境，用0.1M PBS 洗 2 次，1%的鋨酸固定 1～2h，0.1M PBS 洗 2次后，依次用50%、70%、90%乙醇脫水各1 次，每次5～10min。隨后室溫下100%乙醇脫水3 次，用100%乙醇∶環(huán)氧丙烷＝1∶1 室溫浸泡10min，環(huán)氧丙烷室溫浸泡10min，Epon812∶環(huán)氧丙烷＝1∶1 浸透，真空干燥儀（0.2～0.4kg/cm2）2h 以上，Epon812 包埋。組織經(jīng)過 40℃ 2h、60℃ 4h、80℃ 10h 聚合，超薄切片，分別用鈾、鉛染色各15min 和10min，透射電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 飼養(yǎng)8 周后，正常對照組的大鼠飲食、大小便、活動等無明顯變化，皮毛色澤正常，體質(zhì)量明顯增加。與正常組大鼠相比，各模型組在造模等1 周均出現(xiàn)活動遲緩、精神不振、尿量增多、飲水量明顯增多、皮毛缺乏光澤、黃褐色毛發(fā)等癥狀。模型組大鼠飼養(yǎng)過程中，各時間點的體質(zhì)量與正常組相比，均明顯減輕（P<0.05）。與模型組相比，各時間段外照組、頻譜水組、鹽酸二甲雙胍組（陽性藥組）的大鼠以上情況得到不同程度的回升，其中鹽酸二甲雙胍組在第4周、第6 周及第8 周體重與模型組相比明顯升高（P<0.05）。見表 1。

2.2 血糖試紙法測定空腹血糖 模型組大鼠的空腹血糖在 2、4、6、8 周末均明顯高于正常對照組（P<0.05）。鹽酸二甲雙胍組在4、6、8 周末低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組。外照組、瀕譜水組大鼠第6 周、第8 周的血糖水平較模型組有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但仍高于正常組。見表2。

表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別 n 0 周 2 周末 4 周末 6 周末 8 周末正常對照組 18 269.00±12.96 356.62±29.13 377.87±31.65 483.25±36.12 543.87±41.50模型組 18 264.00±18.71 298.59±27.33* 305.44±49.73* 386.87±70.82* 415.00±87.2*外照組 18 259.72±13.99 296.56±21.02* 307.13±39.41* 394.07±57.29* 445.33±78.17頻譜水組 18 266.94±18.21 291.16±27.13* 308.27±47.04* 384.41±76.47* 420.28±76.38鹽酸二甲雙胍組 18 262.81±12.64 307.13±25.12* 343.57±28.87△ 436.79±46.76△ 483.07±73.19△

表2 各組大鼠不同時間點空腹血糖變化（mmol/L，）

表2 各組大鼠不同時間點空腹血糖變化（mmol/L，）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別 n 2 周末 4 周末 6 周末 8 周末正常對照組 18 5.80±0.919 5.86±1.338 5.30±0.298 6.15±0.602模型組 18 19.09±5.608* 19.62±3.944* 21.31±5.185* 24.73±3.142*外照組 18 19.45±4.405* 17.52±5.605* 19.65±5.104* 21.40±7.674*頻譜水組 18 20.08±6.074* 20.65±5.181* 19.73±6.963* 20.47±7.674*鹽酸二甲雙胍組 18 18.48±2.396* 13.06±6.113*△ 13.46±5.589*△ 16.52±5.694*△

2.3 血清學檢測腎功能指標水平 血清檢測顯示，模型組尿酸、尿素氮、肌酐水平均高于正常對照組（P<0.05）；外照組、頻譜水組、鹽酸二甲雙胍組的血清尿酸較模型組下降（P<0.05）；鹽酸二甲雙胍組的尿素氮低于模型組（P<0.05）；外照組、頻譜水組、鹽酸二甲雙胍組的肌酐含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 各組大鼠血清尿酸、尿素、肌酐變化（）

表3 各組大鼠血清尿酸、尿素、肌酐變化（）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

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2.4 血清學檢測24h 尿微量白蛋白水平 大鼠尿微量白蛋白結果顯示，4 周末，模型組大鼠尿微量白蛋白明顯高于模型組（P<0.05），而鹽酸二甲雙胍組較模型組水平下降（P<0.05）；8 周末，模型組與正常組相比無差異（P＞0.05），除外照組較正常組、模型組明顯升高外（P<0.05），其他處理組與模型組、正常組之間無差異（P＞0.05）。見表 4。

表4 各組大鼠24h 尿微量白蛋白變化（mg/L，）

表4 各組大鼠24h 尿微量白蛋白變化（mg/L，）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別 n 4 周末 8 周末正常對照組 8 4.908±3.9569 4.934±3.5438模型組 8 8.182±2.9979* 5.989±4.4301外照組 8 4.612±3.7031 10.395±4.9801*△頻譜水組 8 4.273±4.4167 6.720±3.5725鹽酸二甲雙胍組 8 2.838±1.8829△* 5.688±3.0978

2.5 腎組織病理學觀察 大鼠腎組織HE 染色結果顯示，正常組的大鼠腎小球、腎小管結構清晰，間質(zhì)毛細血管豐富（圖1A）。模型組的大鼠見部分腎小球系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細胞出現(xiàn)細胞水腫，有的可見明顯空泡，部分腎小管可見蛋白管型，腎間質(zhì)有炎細胞浸潤（圖1B）。外照組、頻譜水組、均可見腎小球有輕度系膜基質(zhì)增生，部分腎小管上皮細胞空泡變性，部分腎小管上皮細胞萎縮（圖1C、D）。鹽酸二甲雙胍組大鼠的腎小球結構較清晰，腎小管上皮細胞有輕度細胞水腫，胞漿染色呈顆粒狀（圖1E）。

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色（20×）

圖2 各組大鼠腎組織超微結構（11 500×）

大鼠腎組織透射電鏡結果顯示，正常組腎小管上皮細胞線粒體豐富，結構清晰正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上附著大量核糖體（圖2A）。模型組腎小管上皮細胞線粒體數(shù)量減少且受損嚴重，線粒體腫脹，膜破裂，線粒體嵴縮短、溶解、消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、變短，膜上核糖體大量脫落（圖2B）。外照組、頻譜水組、鹽酸二甲雙胍組腎小管上皮腎細胞線粒體較豐富，結構清晰正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上附著大量核糖體（圖2C、D、E）。

3 討論

STZ 已成為目前廣泛采用的糖尿病動物模型的化學誘導劑，通過損壞胰島β 細胞，使其壞死，胰島素分泌不足而產(chǎn)生糖尿病的臨床癥狀。本實驗中，模型組血糖明顯高于正常對照組，表明模型成功。當高血糖達到一定程度后，能夠?qū)е赂靼薪M織出現(xiàn)功能改變及病變［2］。糖尿病腎病是糖尿病臨床常見的并發(fā)癥，是一種由于高血糖導致的，持續(xù)性的腎臟損害，其特點表現(xiàn)為持續(xù)的白蛋白尿及不斷下降的腎小球濾過率（GFR）［3］，GFR 是評價腎臟濾過功能的最重要的指標之一，是指單位時間內(nèi)從腎小球濾過的血漿容量（mL/min）。由于人體內(nèi)的腎小球數(shù)目眾多，無法直接測定GFR［4］，因此通常通過血肌酐等簡便易得的臨床檢測指標進行估算，同時根據(jù)2010 年腎臟病理學會（RPS）國際專家組提出的糖尿病腎病病理分級標準［5］，對腎臟組織光鏡、免疫熒光和電鏡下組織病理學的改變對腎小球、腎小管、腎間質(zhì)以及腎臟血管和小動脈的透明硬化等病理狀況進行評價，從而對糖尿病腎病的情況進行綜合評價。駿豐頻譜治療保健儀發(fā)射的紅外頻譜范圍廣，具有改善局部血流循環(huán)，減輕肌肉緊張，解除肌肉痙攣等生物醫(yī)學效應。紅外線可深入組織，由照射部位溫度和局部血管擴張引起的熱效應，血液循環(huán)速度加快［6］。通過紅外頻譜照射，能夠有效促進大鼠周身血液循環(huán)，同時使腎動脈及腎小血管擴張，使單位時間內(nèi)通過腎臟的血流量增加，在一定程度上緩解了GFR 的下降，對于恢復GFR 有一定積極作用。李雁等［7］針對頻譜水的安全評價發(fā)現(xiàn)，頻譜水安全、無毒，能夠提高機體免疫力［8］，且頻譜水在一定程度上可以降低紅細胞、血小板聚集、減輕血管內(nèi)皮水腫程度，改善血管內(nèi)皮損傷、出血等微循環(huán)障礙［9］。由于糖尿病大鼠腎小球系膜增生，腎小球毛細血管硬化，足細胞等結構的缺失融合，因此在通過頻譜水治療后，可能在一定程度上通過對血管內(nèi)皮的保護作用以及對微循環(huán)的改善，恢復GFR，維持腎小球及腎小管結構，保護腎單位，緩解蛋白尿及血尿的發(fā)生。本研究結果表明，糖尿病大鼠模型進行飲用頻譜水或者紅外頻譜照射8 周，在一定程度上可以降低糖尿病大鼠模型血清肌酐和尿酸水平，但是不能有效降低24h 尿微量白蛋白，并且可以減輕糖尿病大鼠模型的腎小管上皮細胞變性，維持腎小管上皮細胞線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構。

綜上所述，紅外頻譜照射或飲用超低頻電磁場處理水可以改善糖尿病模型大鼠空腹血糖水平，可以改善腎臟功能，其機制可能是通過改善細胞內(nèi)能量代謝及扭轉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)來起到保護腎功能的作用。