李夢(mèng)盈，姜莉苑，李繼君

（1.衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 衢州324000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)學(xué)中心中西醫(yī)結(jié)合科，上海200127）

抽動(dòng)穢語綜合征（tourette's syndrome，TS）是一種發(fā)育神經(jīng)精神障礙，臨床上以面部、四肢、軀干等部位肌肉出現(xiàn)不自主、快速、無目的的反復(fù)抽動(dòng)等刻板行為為主癥，少部分患兒可伴有喉部異常發(fā)聲、猥穢言語等癥狀的綜合癥候群。TS患兒常伴有多動(dòng)、強(qiáng)迫等行為及情緒障礙，如注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）、強(qiáng)迫性障礙（OCD）、情緒障礙及其他自傷行為。部分患者抽動(dòng)可導(dǎo)致終生疾患，約5%的患兒有生命危險(xiǎn)癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。近年來，TS發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，因此，盡早選擇安全有效的治療方法具有重要意義。目前TS主要采用西醫(yī)藥物治療，其中氟哌啶醇、利培酮、硫必利等精神類藥物已成為治療TS的一線藥物，西藥能抑制患兒大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的興奮性，發(fā)揮減輕抽動(dòng)癥狀的效果。但氟哌啶醇服用后產(chǎn)生的不良反應(yīng)與藥物干預(yù)劑量、時(shí)間密切相關(guān)，目前臨床上常見的不良反應(yīng)包括帕金森樣震顫、嗜睡、坐立不安、頭痛、強(qiáng)迫性張口、斜頸、反復(fù)徘徊、伸舌、消化道癥狀等，導(dǎo)致患兒無法耐受，最終中斷治療。

寧動(dòng)顆粒是李安源教授的經(jīng)驗(yàn)方[2-3]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，寧動(dòng)顆粒可影響TS模型大鼠抽動(dòng)刻板行為及學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制與抑制多巴胺（DA）系統(tǒng)的興奮性密切相關(guān)。本研究探究寧動(dòng)顆粒對(duì)抽動(dòng)-穢語綜合征模型大鼠行為學(xué)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，由上海兒童醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí),合格證號(hào)：11401500007810，體質(zhì)量（100±20）g，動(dòng)物房室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度45%～65%，采用12 h光照黑暗自動(dòng)循環(huán)。將寧動(dòng)顆粒（深圳三九中藥有限公司，批號(hào)：201603212）用蒸餾水稀釋為實(shí)驗(yàn)所需的濃度后使用；氟哌啶醇（Hal，上海安心八福藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H86749384，規(guī)格：2 mg/片）灌胃藥液配制：氟哌啶醇2 mg+0.9%氯化鈉溶液2 mL（將1片Hal研磨成細(xì)末，溶入2 mL 0.9%氯化鈉溶液），現(xiàn)配現(xiàn)用；阿樸嗎啡（Apo，美國Sigma公司，批號(hào)：079K6547）注射液配制：阿樸嗎啡1 mg+無菌生理鹽水1 mL，充分溶解后避光使用[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 TS動(dòng)物模型24只Wistar TS模型大鼠隨機(jī)分為阿樸嗎啡組（CTR，n=8）、氟哌啶醇組（Hal，n=8）和寧動(dòng)顆粒組（NDG，n=8）。3組大鼠均腹腔注射阿樸嗎啡1.0 mg/（kg·d），連續(xù)注射藥物4周。在造模情況下，同時(shí)，進(jìn)行藥物干預(yù)。CTR組給予等量蒸餾水；NDG組給予寧動(dòng)顆粒370 mg/（kg·d）（相當(dāng)于臨床用量的15倍）；Hal組給予氟哌啶醇10 mg/（kg·d）（相當(dāng)于臨床用量的10倍）。各組大鼠均灌胃藥物干預(yù)，每天上午10：00藥物干預(yù)1次，藥物灌胃連續(xù)干預(yù)8周。

1.2.2 大鼠抽動(dòng)刻板行為測(cè)試在給大鼠注射阿樸嗎啡及在干預(yù)治療15 min后，開始觀察大鼠的刻板活動(dòng)，包括：咬、嗅、舔（不包含理毛）、挖洞、迅速移位、急速跳躍等。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道。評(píng)分方法：0分，無刻板運(yùn)動(dòng)；1分，動(dòng)物鼻嗅增加，常伴有抬頭活動(dòng)；2分，動(dòng)物不連續(xù)地嗅增加，伴有身體抬高；3分，動(dòng)物不連續(xù)地嗅增加，伴有頭和身體原地抬高運(yùn)動(dòng)的舔，偶然的快速的爆發(fā)性的自發(fā)活動(dòng)（2～5步）；4分，動(dòng)物連續(xù)地嗅、咬、舔、搖頭及反復(fù)的身體抬高、爬墻；5分，動(dòng)物連續(xù)地嗅、咬、舔、搖頭及連續(xù)地身體抬高、爬墻，并伴有前爪不著地。

1.2.3 認(rèn)知及其他行為測(cè)試①開場(chǎng)試驗(yàn)：制一個(gè)底為60 cm×60 cm的正方形、高為40 cm的木箱，用線將箱子底部分為20 cm×20 cm的9個(gè)正方形小格子，在正式實(shí)驗(yàn)前1天，將大鼠放進(jìn)9個(gè)方格中最中央的格子內(nèi)20 min以適應(yīng)箱子的環(huán)境，從而減少大鼠因?qū)Νh(huán)境陌生而產(chǎn)生焦慮不安的情緒，進(jìn)而影響其正常的活動(dòng)水平。正式實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將每只大鼠放進(jìn)最中央的格子內(nèi)，通過攝像機(jī)對(duì)大鼠5 min內(nèi)的實(shí)際活動(dòng)情況進(jìn)行行為攝像，刻錄成光盤后，通過盲法觀察和記錄大鼠在中央方格內(nèi)停留的時(shí)間、大鼠直立次數(shù)、穿越格子的數(shù)量、梳理毛的次數(shù)。在每次大鼠測(cè)試結(jié)束后，清潔測(cè)試區(qū)域，同時(shí)，注意保持測(cè)試期間的噪聲及周邊光線亮度的一致性[9]。②Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：迷宮是一個(gè)圓形恒溫的乳白色鐵制水池，直徑120 cm，高50 cm，按東、南、西、北4個(gè)方向?qū)⑺仄骄鶆澐譃?個(gè)象限（NE、SE、SW、NW），再將直徑10 cm，高度為30 cm的圓形平臺(tái)放入迷宮水池中，注入乳白色不透明液體，使圓形平臺(tái)隱沒在水下2 cm，水溫（20±2）℃，平臺(tái)可置于任意一個(gè)象限中央。在正式實(shí)驗(yàn)之前，在水池中不設(shè)立平臺(tái)，讓大鼠在池內(nèi)自由游60 s，以消除焦慮適應(yīng)新的環(huán)境。實(shí)驗(yàn)第1～4天，連續(xù)4 d，將大鼠從4個(gè)不同的象限下水，通過拍攝記錄大鼠尋找并站到隱藏平臺(tái)所需的時(shí)間。若大鼠在120 s內(nèi)找到平臺(tái)，則讓其在平臺(tái)上停留30 s，使大鼠觀察并記住空間的參照物。若大鼠在120 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則由測(cè)試者引導(dǎo)上平臺(tái)，并同樣停留30 s。每天測(cè)試連續(xù)4次，當(dāng)天的成績(jī)?yōu)?次的平均值，進(jìn)而監(jiān)測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[10-12]。

1.3 觀察指標(biāo)觀察對(duì)4組大鼠行為學(xué)的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，開場(chǎng)試驗(yàn)采用單因素方差分析，Morris水迷宮采用一般線性模型的Repeated Measures ANOVA方差分析，比較用t檢驗(yàn)，兩組間的相關(guān)性分析用雙變量相關(guān)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TS模型大鼠抽動(dòng)行為評(píng)估連續(xù)注射Apo 4周后大鼠出現(xiàn)持續(xù)且穩(wěn)定的刻板活動(dòng)。藥物干預(yù)第5周，Hal組和NDG組與CTR組相比，大鼠刻板活動(dòng)明顯減弱（P＜0.05），藥物干預(yù)第8周差異最大（P＜0.05），見表1。

表1 3組TS模型大鼠抽動(dòng)行為比較（±s，次）Table 1 Comparison of the twitch behavior monitoring among three groups of TS model rats(±s,times)

表1 3組TS模型大鼠抽動(dòng)行為比較（±s，次）Table 1 Comparison of the twitch behavior monitoring among three groups of TS model rats(±s,times)

注：與CTR組比較，aP＜0.05

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2.2 TS模型大鼠開場(chǎng)試驗(yàn)中的行為表現(xiàn)NDG組干預(yù)8周后，大鼠在中央停留時(shí)間顯著增加（P＜0.05）；Hal組藥物干預(yù)前后大鼠在中央停留時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)8周后，NDG組穿格子次數(shù)減少，與CTR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hal組穿格子次數(shù)與CTR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NDG組干預(yù)后，大鼠直立次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。Hal組藥物干預(yù)前后各項(xiàng)目比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)8周后，NDG組大鼠修飾次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。Hal組藥物干預(yù)前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 TS模型大鼠水迷宮試驗(yàn)中的行為表現(xiàn)3組大鼠隨著多次重復(fù)練習(xí)，找到平臺(tái)的時(shí)間均減少，均低于第1天的時(shí)間（P＜0.05），且NDG組找到平臺(tái)的時(shí)間明顯低于Hal組和CTR組（P＜0.05），但Hal組和CTR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表2 3組TS模型大鼠開場(chǎng)試驗(yàn)行為表現(xiàn)比較（±s）Table 2 Comparison of the opening test among three groups of TS model rats(±s)

表2 3組TS模型大鼠開場(chǎng)試驗(yàn)行為表現(xiàn)比較（±s）Table 2 Comparison of the opening test among three groups of TS model rats(±s)

注：與干預(yù)前比較，aP＜0.05

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表3 3組TS模型大鼠水迷宮行為表現(xiàn)比較（±s，min）Table 3 Comparison of morris water maze test among three groups of TS model rats(±s,min)

表3 3組TS模型大鼠水迷宮行為表現(xiàn)比較（±s，min）Table 3 Comparison of morris water maze test among three groups of TS model rats(±s,min)

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3 討論

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，TS大鼠出現(xiàn)連續(xù)穩(wěn)定不自主且快速的抽動(dòng)刻板行為，這是由于Apo的誘導(dǎo)增強(qiáng)了黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)功能，從而誘導(dǎo)并增強(qiáng)了大鼠的刻板行為，連續(xù)注射Apo，進(jìn)而使大鼠出現(xiàn)連續(xù)且穩(wěn)定的抽動(dòng)行為，然后運(yùn)用NDG及Hal對(duì)抽動(dòng)模型大鼠進(jìn)行治療，結(jié)果表明，治療組和非治療組在刻板行為方面有顯著性變化，兩組均能明顯減弱Apo誘導(dǎo)的TS模型大鼠抽動(dòng)刻板行為，與CTR組相比，治療組抽動(dòng)行為在抽動(dòng)的持續(xù)時(shí)間、頻率及復(fù)雜程度均顯著減弱。提示NDG在治療TS抽動(dòng)刻板效果與西藥Hal療效相當(dāng)，但NDG安全性高于Hal。

臨床上患TS癥狀的患兒通常伴有學(xué)習(xí)困難問題，而智力水平的高低則直接影響患兒的學(xué)習(xí)成績(jī)。有文獻(xiàn)[13]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TS患兒的智力水平大多處于正?；蜻吘墵顟B(tài)，且即使TS患兒的智力水平在正常范圍內(nèi)，但與正常兒童相比仍處于較差狀態(tài)。記憶是人腦對(duì)過去活動(dòng)、感受、經(jīng)驗(yàn)的印象累積，通常分為長(zhǎng)時(shí)記憶、短時(shí)記憶及瞬時(shí)記憶。有研究表明TS患兒的瞬時(shí)記憶和短時(shí)記憶可能存在一定程度的缺陷[14]。Bomtcin RA[15]對(duì)28例TS患兒采用Halsetad兒童神經(jīng)心理成套量表測(cè)試，發(fā)現(xiàn)TS患兒的觸覺操作評(píng)分異常，提示TS患兒存在空間記憶能力缺陷。劉智勝等[16]采用韋氏兒童記憶量表對(duì)TS患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患兒總記憶商數(shù)雖在正常范圍，但在背數(shù)和視覺再生測(cè)驗(yàn)結(jié)果明顯低于正常水平，提示抽動(dòng)患兒的短時(shí)記憶存在缺陷。此外，背數(shù)異常可反映患兒注意能力缺陷，這可能與TS共患ADHD存在一定的相關(guān)性。本研究顯示，NDG干預(yù)可有效改善TS模型大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。

開場(chǎng)試驗(yàn)是觀察多動(dòng)行為再現(xiàn)使用最多的試驗(yàn)，該試驗(yàn)主要反映大鼠在陌生環(huán)境下自發(fā)活動(dòng)能力，通常以大鼠直立次數(shù)、穿越格子數(shù)等指標(biāo)反應(yīng)其自發(fā)活動(dòng)能力，大鼠格子數(shù)穿越次數(shù)多代表大鼠的水平活動(dòng)越高，而直立次數(shù)可表示大鼠垂直活動(dòng)水平能力，直立次數(shù)越多表示大鼠垂直活動(dòng)水平越高。在開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，TS模型大鼠表現(xiàn)出多動(dòng)、焦慮及激惹狀態(tài)，其在中央停留時(shí)間短，穿格子數(shù)、直立次數(shù)及修飾次數(shù)多。大鼠在NDG干預(yù)8周后，其在中央停留時(shí)間較藥物干預(yù)前明顯增加，說明NDG能有效改善TS模型大鼠焦慮及激惹等狀態(tài)，可能與NDG改善多巴胺系統(tǒng)紊亂有關(guān)；同時(shí)，NDG組穿越格子數(shù)、修飾次數(shù)和直立次數(shù)也隨之顯著減少。說明NDG能明顯改善TS模型大鼠多動(dòng)及刻板的癥狀。

Morris水迷宮是測(cè)評(píng)學(xué)習(xí)記憶能力最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)，通過定位航行試驗(yàn)反應(yīng)其空間記憶的保持能力。每天從4個(gè)不同點(diǎn)將大鼠分別放入水中若干次，并記錄大鼠找到隱蔽在水下平臺(tái)所需要的時(shí)間。隨著訓(xùn)練的增多，大鼠逐漸學(xué)會(huì)找到固定位置的平臺(tái)，進(jìn)而形成對(duì)空間位置的認(rèn)知。本研究結(jié)果顯示，在藥物干預(yù)8周后，3組大鼠隨著多次重復(fù)的練習(xí)期間，找到平臺(tái)的時(shí)間均減少，且與第1天找到平臺(tái)時(shí)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明大鼠均有學(xué)習(xí)和記憶的能力，且NDG組找到平臺(tái)的時(shí)間更短，表明NDG改善TS模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力強(qiáng)于Hal組和CTR組；Hal組找到平臺(tái)的時(shí)間與CTR組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Hal改善或者提高大鼠學(xué)習(xí)記憶效果顯著。提示TS大鼠存在學(xué)習(xí)記憶能力的缺陷，與臨床現(xiàn)象相符，NDG改善TS模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力強(qiáng)于Hal。

綜上所述，寧動(dòng)顆?？娠@著抑制TS模型大鼠抽動(dòng)刻板行為，且可改善TS模型大鼠多動(dòng)及學(xué)習(xí)記憶能力。