許楊　尹侃　李霄霞　狄國虎　侯琳　趙春華

[摘要]目的基于自噬相關基因（ATGs）構建肝細胞癌病人預后風險模型。方法TCGA數(shù)據(jù)庫下載374例肝細胞癌及50例正常肝組織的轉錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，首先篩選出差異表達基因（DEGs），然后從中篩選出差異表達的ATGs（DEATGs），最終利用單因素Cox回歸分析、LASSO回歸分析以及多因素Cox回歸分析構建預后風險模型，并應用ROC曲線評估模型對于肝細胞癌病人預后的預測能力。結果肝細胞癌組織與正常肝組織篩選得到12 471個DEGs，其中包含62個DEATGs。單因素Cox回歸分析得到40個預后相關DEATGs，LASSO回歸分析以及多因素Cox回歸分析得到7個風險自噬基因（RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1和GAPDH）用于構建預后風險模型。Kaplan-Meier分析顯示，高風險組病人的總體生存期顯著低于低風險組（χ2=36.972，P<0.05）。多因素Cox回歸分析表明，預后風險模型可以作為一個獨立預后因素（HR=2.574，P<0.01）。結論基于ATGs構建的預后風險模型是一個獨立的預后因素，可有效預測肝細胞癌病人的預后。

[關鍵詞]癌，肝細胞;自噬;基因;預后;計算生物學

[中圖分類號]R730.7[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0001-07

[ABSTRACT]ObjectiveTo establish a prognostic risk model for patients with hepatocellular carcinoma （HCC） based on autophagy-related genes （ATGs）. MethodsThe transcriptome data and clinical information of 374 HCC samples and 50 normal liver tissue samples were downloaded from TCGA database. Firstly， differentially expressed genes （DEGs） were screened out， then differentially expressed ATGs （DEATGs） were screened out， and finally， the univariate Cox regression analysis， the LASSO regression analysis， and the multivariate Cox regression analysis were used to establish a prognostic risk model and the receiver ope-rating characteristic curve was used to evaluate the value of this model in predicting the prognosis of HCC patients. ResultsA total of 12 471 DEGs were screened out from HCC tissue and normal liver tissue， including 62 DEATGs. The univariate Cox regression analysis obtained 40 DEATGs associated with prognosis， and the LASSO regression analysis and the multivariate Cox regression analysis obtained 7 risk autophagy genes （RAB7A， FOS， ATG9A， HSPA8， PRKN， TUSC1， and GAPDH） which were used to establish the prognostic risk model. The Kaplan-Meier analysis showed that the patients in the high-risk group had a significantly lower overall survival than those in the low-risk group （χ2=36.972，P<0.05）. The multivariate Cox regression analysis showed that the prognostic risk model could be used as an independent prognostic factor （HR=2.574，P<0.01）. ConclusionThe risk prognostic model based on ATGs is an independent prognostic factor and can effectively predict the prognosis of HCC patients.

[KEY WORDS]carcinoma， hepatocellular; autophagy; genes; prognosis; computational biology

肝細胞癌（HCC）是癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率逐年遞增[1]。HCC的治療主要包括手術切除、分子靶向治療和肝移植等[2]。然而，由于其具有惡性程度高以及術后易復發(fā)等特點，許多國家HCC的發(fā)病率和死亡率還在持續(xù)上升[3]。盡管多項研究提出了包括病人的基本特征（如年齡和性別）和腫瘤相關因素（如腫瘤分級）等在內(nèi)的預后因素，可用于預測HCC病人的生存狀態(tài)[4-5]，但是仍然缺乏有效的預后因素。自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑[6]，由一系列高度協(xié)同的信號通路調(diào)控，發(fā)生在所有細胞的基礎水平，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用[7-8]。研究結果顯示，自噬在多種疾病如癌癥、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等病理過程中起關鍵作用[9]。自噬參與調(diào)控HCC的進程[10-11]。癌癥基因組圖譜（TCGA）計劃是通過大規(guī)模測序的基因組分析技術來繪制人類腫瘤的基因組圖譜[12]，其中包含33種癌癥[13-14]。本研究基于TCGA公共數(shù)據(jù)庫中HCC轉錄組數(shù)據(jù)和臨床信息進行分析，構建預后風險模型并將其應用于HCC的預后預測?，F(xiàn)將結果報告如下。

1資料和方法

1.1數(shù)據(jù)資料收集及處理

研究涉及的數(shù)據(jù)資源下載于TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/），其中包括所有HCC病人RNA-seq數(shù)據(jù)及相關的臨床數(shù)據(jù)。從人類自噬數(shù)據(jù)庫（HADb，http：//www.autophagy.lu/）下載232個自噬相關基因（ATGs）。根據(jù)病人的ID號碼將轉錄組數(shù)據(jù)與病人的臨床信息進行匹配，最終從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得了365例病人完整的生存信息和基因表達譜數(shù)據(jù)。

1.2差異表達的ATGs（DEATGs）的鑒定

利用edgeR函數(shù)包對數(shù)據(jù)進行分析，以FDR<0.05和|fold change（FC）|>1為條件，篩選HCC組織和正常組織樣本中的差異表達基因（DEGs）以及DEATGs。

1.3預后風險模型的構建

使用Survival函數(shù)包對DEATGs進行單因素Cox回歸分析，以P<0.05為條件篩選影響預后的DEATGs，使用LASSO回歸分析降維，納入多因素Cox回歸分析得到了用于HCC預后模型的風險ATGs。建立預后風險模型評分公式如下：風險評分=∑nj=1Coefj×Xj，其中Coef為ATGs的多變量回歸分析系數(shù)，X為各ATGs的相對表達水平。根據(jù)公式為每個病人生成風險評分，并以風險評分中位數(shù)為界值，將病人分為高風險組和低風險組，高風險組提示病人預后差。采用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗評估兩組病人的總體生存期，并利用ROC曲線及曲線下面積（AUC）評估該預后模型的準確性。

1.4統(tǒng)計學方法

使用R3.6.1軟件（https：//www.R-project.org/）進行統(tǒng)計學分析及圖形繪制。采用Cox回歸分析風險比（HR）及其95%可信區(qū)間（CI）評價ATGs表達與預后的關聯(lián)。使用Cox回歸分析和LASSO回歸分析降維篩選模型相關風險ATGs，構建多基因預后風險模型。利用ROC曲線和AUC評估預后風險模型的預測能力。采用單因素和多因素Cox回歸分析確定具有獨立預后價值的因素。利用Wilcoxon-signedrank檢驗和Kruskal檢驗分析臨床變量與ATGs的關系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1DEATGs的篩選和富集分析

共篩選出12 471個DEGs（圖1A），并進一步從中篩選出62個DEATGs（圖1B）。對DEATGs進行Gene Ontology（GO）分析，包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）。DEATGs在BP組中自噬和利用自噬機制的過程等方面顯著富集、CC組中空泡膜和膜區(qū)域等方面顯著富集、MF組中蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和激酶調(diào)節(jié)活性等方面顯著富集（圖1C）。此外，KEGG通路分析顯示，DEATGs主要富集于自噬、細胞凋亡和人乳頭瘤病毒感染等方面（圖1D）。

2.2預后風險模型風險ATGs的構建

對62個DEATGs進行單因素Cox回歸分析，共有40個與HCC預后顯著相關的ATGs納入后續(xù)的分析。經(jīng)過LASSO回歸分析降維，再使用多因素Cox回歸分析，最終得到了7個與HCC預后相關的風險ATGs（RAB7A、GAPDH、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1和FOS），風險ATGs與HCC預后的關聯(lián)見圖2。利用風險評分函數(shù)構建預后風險模型，風險評分=（RAB7A表達量×0.445 444 289）+（FOS表達量×0.217 687 513）+（ATG9A的表達量×0.542 642 682）+（HSPA8的表達量×0.218 555 915）+（PRKN的表達量×-0.727 657 489）+（TUSC1表達量×0.337 901 906）+（GAPDH表達量×0.246 856 663）。

2.3預后風險模型的評價

基于上述風險評分函數(shù)生成每個病人的風險評分，高風險組 182例，低風險組183例。隨著風險評分的升高，病人的生存期縮短且死亡例數(shù)增加（圖3A）。Kaplan-Meier分析顯示，高風險組病人的總體生存期較低（χ2=36.972，P<0.05）。ROC曲線分析顯示，風險評分模型對HCC病人1～9年總生存期預測的AUC值分別為0.733、0.696、0.726、0.692、0.692、0.669、0.742、0.737和0.729（圖3B、C）。

1期許楊，等. 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的肝細胞癌自噬相關基因預后風險模型的建立3

A為12 471個DEGs熱圖，N為正常肝組織，T為HCC組織;B為62個DEATGs熱圖，N為正常肝組織，T為HCC組織;C為DEATGs GO分析;D為DEATGs KEGG分析。

A為LASSO回歸模型中采用10折交叉驗證方法篩選出的14個ATGs;B為40個ATGs在LASSO模型中的回歸系數(shù)圖譜;C為多因素Cox分析篩選出來的7個風險ATGs。

2.4ATGs預后風險模型的獨立預后價值

單因素Cox回歸分析顯示，病人的腫瘤分期（HR=1.865，95%CI=1.456～2.388，P<0.05）、腫瘤浸潤深度（HR=1.804，95%CI=1.434～2.270，P<0.05）、腫瘤遠處轉移（HR=3.850，95%CI=1.207～12.281，P<0.05）和風險評分模型（HR=3.029，95%CI=2.160～4.248，P<0.05）為預后預測因素。多因素Cox回歸分析顯示，風險評分是HCC病人的獨立預后因素（HR=2.574，95%CI=1.801～3.677，P<0.05）。見表1。

A為HCC高風險組、低風險組生存時間及7個風險ATGs表達分布圖;B為HCC高風險組、低風險組Kaplan-Meier分析;C為應用ROC曲線對預后風險模型進行1～9年生存期的預測性能評價。

2.5預后風險模型的臨床應用

為了檢驗預后風險模型預測HCC進展的能力，分析了風險因素（風險評分和風險基因）與臨床變量（生存狀態(tài)、年齡、性別、病理組織分級和病理TNM分期）之間的關系。結果顯示，隨著RAB7A、TUSC1和風險評分因素的增加，HCC病人生存狀態(tài)變差（t=-5.265～-2.175，P<0.05），腫瘤浸潤深度增加（t=-3.613～-2.644，P<0.05）（圖4A～F）;隨著RAB7A、ATG9A、TUSC1和風險評分的增加，HCC病人的病理分期增加（t=-3.737～-1.992，P<0.05）（圖4H～J）。高風險組病人自噬基因RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、TUSC1和5GAPDH表達高于低風險組（t=3.848～7.467，P<0.05）（圖4L～Q），PRKN基因表達低于低風險組（t=-3.741，P<0.05）（圖4R）。隨著FOS基因表達的增加，HCC病人病理組織分級明顯降低（t=3.542，P<0.05）（圖4K）。

3討論

HCC病人術后高復發(fā)率和化療藥物耐藥性的產(chǎn)生是肝癌病人病死率高的主要因素。因此，預測HCC預后的可靠分子標志物對于指導病人的預后具有重要意義。業(yè)已證實，ATGs參與多種腫瘤的進展和預后，例如結直腸癌、膀胱癌和小細胞性肺癌等[15-17]。本研究結果顯示，ATGs與HCC的臨床病理特征和預后密切相關。本文通過對HCC腫瘤組織和正常組織DEGs表達的分析，篩選出62個DEATGs。GO分析顯示，DEATGs在BP組中自噬和利用自噬機制的過程等方面顯著富集、CC組中空泡膜和膜區(qū)域等方面顯著富集、MF組中蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和激酶調(diào)節(jié)活性等方面顯著富集。KEGG富集分析顯示，DEATGs主要富集在自噬、細胞凋亡和人乳頭瘤病毒感染等方面。本文應用單因素Cox回歸、LASSO回歸分析和多因素Cox回歸分析，確定7個風險ATGs（RAB7A、GAPDH、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1和FOS）構建的預后風險模型;Kaplan-Meier分析顯示，高風險組的生存期明顯低于低風險組。本文還分析了風險評分模型中的因素與某些臨床特征的關系，研究結果顯示模型中的一些因素（如基因RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、TUSC1和GAPDH表達）的增加與HCC的病情進展呈正相關。提示本文構建的模型在預測HCC發(fā)展、演化等方面具有較高的臨床適用性，并為ATGs在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究提供了信息。

FOS是一種核原癌基因，編碼c-Fos，參與細胞增殖和凋亡的調(diào)控。有研究顯示，HCC組織中c-Fos高表達[18]。免疫組化研究顯示，HCC腫瘤組織中c-Fos的表達明顯高于非腫瘤組織[19]。本文研究結果表明，F(xiàn)OS與HCC病人預后相關，并隨著病理組織分級的增高，其表達量下降，提示FOS在HCC的進展中可能發(fā)揮保護性作用，為進一步研究提供了更多的信息。ATG9A是一種跨膜蛋白，可以促進自噬體的形成[20]，有研究表明ATG9A在HepG2細胞中高表達[21]，而ATG9A基因的沉默則抑制膠質(zhì)瘤生長[22]。本文研究結果顯示，ATG9A與HCC病人預后相關，并隨著腫瘤分期的增加，其表達量升高，提示ATG9A是HCC發(fā)生發(fā)展的一個危險因素。HSPA8是應激蛋白，也是肝癌的早期生物標志物，HSPA8高表達提示HCC復發(fā)[23]。本文研究結果顯示，HSPA8在高危組中的表達高于低危組，提示HSPA8是HCC發(fā)展過程中的危險因素。SHIMIZU等[24]研究顯示，TUSC1基因內(nèi)高甲基化病人的疾病特異性生存期明顯短于未發(fā)生基因內(nèi)高甲基化者。本文研究結果顯示，TUSC1與HCC病人預后有關，隨著TUSC1表達的增加，HCC腫瘤分期升高、腫瘤浸潤深度增加，該結果提示TUSC1是HCC進程中的一個危險因素。另外有研究顯示，GAPDH在HCC病人中表達上調(diào)，GAPDH通過與3-BrPA或GAPDH shRNA的分子靶點作用阻斷腫瘤的進展[25]。本文研究顯示，GAPDH在高危組中表達高于低危組，多因素Cox回歸分析顯示GAPDH是HCC的危險因素。XIE等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RAB7A影響體內(nèi)乳癌細胞增殖和遷移。PRKN通過抑制線粒體鐵介導的慢性炎癥和免疫功能障礙，顯著抑制KRAS驅動的胰腺腫瘤的發(fā)生[27]。DUAN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，PRKN通過EGFR/AKT/mTOR通路抑制肺癌的生長和轉移。但RAB7A和PRKN在HCC中的作用機制研究較少。本文研究單因素、多因素Cox回歸分析顯示，RAB7A和PRKN對于HCC病人的預后具有一定的預測作用，提示RAB7A和PRKN可能是HCC治療的潛在靶點，但這一結論需要大規(guī)模、多中心的基礎實驗以及臨床試驗進一步驗證。

綜上，本研究通過ATGs表達譜分析，篩選出了7個（RAB7A、FOS、ATG9A、HSPA8、PRKN、TUSC1、GAPDH）與HCC病人的預后顯著相關的風險ATGs。基于這7個風險ATGs組成的風險模型能夠很好地識別預后不良高風險的HCC病人，并且可以作為一個獨立的預后因素預測HCC病人的預后?；诖私⒌念A后風險模型對判斷HCC預后顯示出較高的準確率。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）