代曉曉　鞠波

[摘要]目的探討上調(diào)miR-19b表達對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響及機制。方法體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，將其分為對照組、H2O2組、H2O2+miR-NC組和H2O2+miR-19b組，采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組細胞中miR-19b表達，四甲基噻唑藍（MTT）法和流式細胞儀分別檢測細胞存活率和凋亡率，相關(guān)試劑盒檢測細胞上清液中乳酸脫氫酶（LDH）、細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）水平，蛋白印跡（Western blot）檢測各組細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化AKT（p-AKT）等蛋白表達。結(jié)果與對照組相比，H2O2組細胞中miR-19b表達、細胞存活率和細胞內(nèi)SOD、GSH-Px活力及PI3K、p-AKT蛋白表達水平均降低（P均<0.05），而細胞凋亡率、LDH活力和MDA含量均升高（P均<0.05）。與H2O2組相比較，H2O2+miR-19b組miR-19b表達、細胞存活率和細胞內(nèi)SOD、GSH-Px活力以及PI3K、p-AKT蛋白表達水平均升高（P均<0.05），而細胞凋亡率、LDH活力和MDA含量均降低（P均<0.05）。結(jié)論上調(diào)miR-19b表達可提高H2O2誘導的SH-SY5Y神經(jīng)細胞存活率，減輕細胞凋亡和氧化應激損傷，其作用機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]miR-19b;神經(jīng)細胞;細胞凋亡;氧化應激;PI3K/AKT信號通路

[中圖分類號]R322.8;R342.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0082-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-19b upregulation on H2O2-induced SH-SY5Y cell injury and rela-ted mechanism. MethodsSH-SY5Y cells were cultured in vitro and were then divided into control group， H2O2 group， H2O2+miR-NC group， and H2O2+miR-19b group. RT-PCR was used to measure the expression of miR-19b in each group; MTT assay and flow cytometry were used to measure cell viability and apoptosis rate， respectively; related kits were used to measure the level of lactate dehydrogenase （LDH） in cell supernatant and the levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， and glutathione peroxidase （GSH-Px） in cells; Western blot was used to measure the protein expression of phosphoinositide 3-kinase （PI3K）， protein kinase B （AKT）， and phosphorylated AKT （p-AKT）. ResultsCompared with the control group， the H2O2 group had significant reductions in the expression of miR-19b in cells， cell viability， the activities of SOD and GSH-Px in cells， and the protein expression levels of PI3K and p-AKT （all P<0.05）， as well as significant increases in cell apoptosis rate， LDH activity， and MDA content （all P<0.05）. Compared with the H2O2 group， the H2O2+miR-19b group had significant increases in the expression of miR-19b， cell viability， the activities of SOD and GSH-Px， and the protein expression levels of PI3K and p-AKT （all P<0.05）， as well as significant reductions in cell apoptosis rate， LDH activity， and MDA content （all P<0.05）. ConclusionUpregulation of miR-19b can increase the viability of H2O2-induced SH-SY5Y cells and reduce cell apoptosis and oxidative stress injury， possibly by activating the PI3K/AKT signaling pathway.

[KEY WORDS]miR-19b; nerve cells; apoptosis; oxidative stress; PI3K/AKT signaling pathway

阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病嚴重威脅人類生命健康，給病人家庭及社會造成了巨大的經(jīng)濟壓力。研究顯示，氧化應激誘導的神經(jīng)細胞損傷與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]，減輕氧化應激誘導的神經(jīng)細胞損傷對于神經(jīng)退行性疾病的治療尤為重要。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，參與調(diào)控細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應等生理或病理過程，在人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3-5]。MiR-19b是miR-17-92基因簇家族成員，在改善氧化應激所致的心肌損傷、肺損傷等方面發(fā)揮積極作用[6-7]。過氧化氫（H2O2）是細胞氧化代謝的重要產(chǎn)物，可以穿透細胞膜與胞內(nèi)還原型鐵離子反應產(chǎn)生羥自由基，能夠造成多種組織細胞損傷，常用于建立細胞損傷模型[8-9]。有文獻報道，miR-19b在阿爾茨海默病病人血清中表達下調(diào)，而上調(diào)其表達可改善阿爾茨海默病大鼠的認知功能[10]。但目前，miR-19b是否在H2O2誘導的神經(jīng)細胞損傷中發(fā)揮保護作用尚不清楚。因此，本研究主要觀察了上調(diào)miR-19b表達對H2O2誘導的神經(jīng)細胞SH-SY5Y損傷的影響，并探討其可能的分子機制，旨在為改善H2O2所致神經(jīng)損傷提供新靶點。

1材料與方法

1.1主要試劑

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株購于上海銳聰實驗設備有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）和細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）試劑盒購于南京建成科技有限公司，1640培養(yǎng)液、胎牛血清和2.5 g/L胰蛋白酶購于美國Gibco公司，辣根過氧化酶標記的羊抗鼠或兔IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購于美國Santa Cruz公司，四甲基噻唑藍（MTT）試劑購于美國Sigma公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000以及總RNA提取試劑（Trizol試劑）購于美國Invitrogen公司。miR-19b引物序列、miR-19b模擬物及其陰性對照購于廣州銳博生物公司。實時熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒購于大連寶生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組處理采用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37 ℃、飽和濕度和體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y細胞。將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞種植于細胞板上，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合度達75%時，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-19b模擬物及其對照序列分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞。將細胞分為如下4組：①對照組（A組）：SH-SY5Y細胞未處理，常規(guī)培養(yǎng)24 h;②H2O2組（B組）：200 μmol/L的H2O2處理SH-SY5Y細胞24 h;③H2O2+miR-NC組（C組）：200 μmol/L的H2O2處理轉(zhuǎn)染miR-19b模擬物對照序列的SH-SY5Y細胞24 h;④H2O2+miR-19b組（D組）：200 μmol/L的H2O2處理轉(zhuǎn)染miR-19b模擬物的SH-SY5Y細胞24 h。

1.2.2RT-PCR檢測細胞中miR-19b的表達以2.5 g/L胰蛋白酶消化收集處理4組細胞后，采用Trizol法提取各組細胞的總RNA后，使用紫外線分光光度計檢測RNA的濃度與純度。參照RT-PCR試劑盒說明書步驟將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，并以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用廣州銳博生物公司合成的PCR引物上PCR儀進行擴增。PCR引物及其序列見表1。反應條件：95 ℃預變性6 min;95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法檢測各組細胞中miR-19b的表達水平。實驗重復3次。

1.2.3MTT法檢測細胞存活率將細胞接種至96孔細胞板上，按照1.2.1進行分組處理。每組實驗設置5個復孔。處理結(jié)束后，棄上清液，加入5 g/L的 MTT溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。加二甲基亞砜溶液震蕩反應15 min后，用酶標儀檢測各組細胞在490 nm波長處的吸光度值（A），并計算各組細胞的存活率。存活率（%）=（實驗值A/對照組A）×100%。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率將細胞接種至6孔細胞板上，按照1.2.1進行分組處理。處理結(jié)束后，用胰蛋白酶消化收集各組細胞。以磷酸緩沖液洗滌細胞2次后，加入500 μL的 Binding Buffer懸浮細胞，再加入Annexin V-FITC溶液和PI溶液各5 μL，重復混勻后置于避光條件下反應15 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.5MDA含量和LDH、SOD、GSH-Px活力檢測將細胞接種至6孔細胞板上，按照1.2.1進行分組處理。處理結(jié)束后，收集各組細胞及上清液，分別參照LDH、SOD、MDA和GSH-Px試劑盒說明書步驟進行檢測。實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT和p-AKT蛋白的表達將細胞接種至6孔細胞板上，按照1.2.1進行分組處理。處理結(jié)束后，收集各組細胞。加入細胞裂解液提取各組細胞總蛋白后，參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟檢測總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與等體積的Loading buffer充分混勻后，置于沸水浴中煮沸變性5 min。將蛋白樣品以每孔80 μg上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，分離結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜置于含有50 g/L脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h后，轉(zhuǎn)入以1∶1 000比例稀釋的一抗工作液中于室溫下孵育2 h;封閉液洗膜后，然后轉(zhuǎn)入以1∶2 000比例稀釋的二抗工作液中室溫孵育1.5 h。滴加化學發(fā)光劑暗室內(nèi)顯影曝光后，采用凝膠成像系統(tǒng)分別掃描分析各組細胞中PI3K、AKT和p-AKT等蛋白的表達水平。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以±s形式表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細胞miR-19b表達變化

各組間miR-19b的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=148.58，P<0.001）。多重比較結(jié)果顯示：與對照組相比較，H2O2組SH-SY5Y細胞中miR-19b的表達水平明顯降低（P<0.05）;與H2O2組相比，H2O2+miR-19b組細胞中miR-19b的表達水平明顯升高（P<0.05）。見表2。

2.2上調(diào)miR-19b表達對SH-SY5Y細胞存活率和凋亡率的影響

各組間細胞存活率、凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（F=185.84、60.69，P均<0.001）。多重比較結(jié)果顯示：與對照組相比較，H2O2組細胞存活率明顯降低（P<0.05），而凋亡率明顯升高（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義;與H2O2組相比較， H2O2+miR-19b組細胞存活率明顯升高（P<0.05），而細胞凋亡率明顯降低（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。見表2、圖1。

2.3上調(diào)miR-19b表達對SH-SY5Y細胞MDA含量和SOD、GSH-Px、LDH活力影響

各組間MDA、SOD、GSH-Px和LDH差異有統(tǒng)計學意義（F=128.069～288.945，P均<0.05）。多重比較結(jié)果顯示：與對照組相比，H2O2組細胞上清液中LDH活力和細胞內(nèi)MDA含量均升高（P<0.05），而細胞內(nèi)SOD和GSH-Px活力降低（P<0.05）;與H2O2組相比，H2O2+miR-19b組中LDH活力和MDA含量均降低（P<0.05），而SOD和GSH-Px活力升高（P<0.05）。上述各指標差異均有統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4上調(diào)miR-19b表達對SH-SY5Y細胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

各組間PI3K、p-AKT和AKT差別有統(tǒng)計學意義（F=2.349～204.192，P均<0.05）。多重比較結(jié)果顯示：與對照組相比較，H2O2組細胞中PI3K和p-AKT蛋白的表達水平均明顯降低（P<0.05）;與H2O2組相比，H2O2+miR-19b組細胞中PI3K和p-AKT蛋白的表達水平均明顯升高（P<0.05）。見圖2、表4。

3討論

H2O2可產(chǎn)生活性氧，增強細胞膜的通透性，促進細胞色素C釋放，進而激活Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞發(fā)生凋亡[11-13]。LDH是一種反映細胞損傷的糖酵解酶，其釋放量越高，細胞損傷程度越重[14]。SOD是體內(nèi)重要的氧自由基天然清除劑，可減輕自由基對機體組織造成的損傷[15]。GSH-Px也是一種重要的抗氧化酶，且與SOD具有協(xié)同作用[16]。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物之一，其含量高低可間接反映自由基對機體的損傷程度[17]。本文的研究結(jié)果顯示，200 μmol/L的H2O2處理降低了神經(jīng)細胞SH-SY5Y的存活率，提高了細胞凋亡率及細胞上清液中LDH活力和細胞內(nèi)MDA的含量，而降低了細胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活力，表明H2O2誘導了SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷。

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。作為一種miRNA，miR-19b參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進程。研究顯示，miR-19b在失血性休克病人中升高，下調(diào)miR-19b可減輕低氧/復氧誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞功能障礙，降低肺損傷[18]。上調(diào)miR-19b和miR-21可通過靶向下調(diào)PTEN的表達來抑制神經(jīng)元細胞凋亡，減輕脊髓損傷[19]。而減少miR-19b的表達可以改善艾塞那肽對非肥胖糖尿病的治療作用，有效控制血糖并改善炎癥反應和免疫功能，并減少胰島細胞損傷[20]。miR-19b在小鼠哮喘模型中低表達，上調(diào)其表達可通過升高SOD活力和降低MDA含量減輕氧化應激引起的肺組織損傷[7]。本研究以H2O2處理SH-SY5Y神經(jīng)細胞結(jié)果顯示，細胞中miR-19b表達水平明顯降低，提示miR-19b可能在H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。通過轉(zhuǎn)染miR-19b模擬物成功上調(diào)miR-19b表達，而且上調(diào)miR-19b表達提高了H2O2作用下的SH-SY5Y細胞存活率，并降低了細胞凋亡率及細胞上清中LDH活力和細胞中MDA含量，且提高了SOD和GSH-Px的活力。提示上調(diào)miR-19b表達可抑制H2O2誘導的SH-SY5Y細胞凋亡及氧化應激水平，減輕了H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷。這與WEI等[21]報道的miR-19b可減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的結(jié)果一致。

PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要通路之一，AKT在PI3K信號傳導過程中發(fā)揮著樞紐作用，其磷酸化被激活后可通過調(diào)控多種基因的表達在細胞代謝、增殖和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22-23]。已有研究結(jié)果顯示，在H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷過程中PI3K/AKT信號通路受到抑制[24];miR-19b可能通過下調(diào)PTEN表達激活AKT信號通路[25]。為了探討miR-19b在保護H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷中的分子機制，本研究進一步的檢測結(jié)果顯示，上調(diào)miR-19b表達可以逆轉(zhuǎn)H2O2對SH-SY5Y細胞中PI3K和p-AKT蛋白表達的抑制作用，提示miR-19b可能通過激活PI3K/AKT信號通路減輕H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷。

綜上所述，miR-19b在H2O2誘導的神經(jīng)細胞損傷方面發(fā)揮著積極的作用，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本文結(jié)果進一步揭示了miR-19b在神經(jīng)細胞損傷中的作用，為其作為改善H2O2誘導的神經(jīng)細胞損傷的有效靶點提供了新的參考依據(jù)。但本研究僅在細胞層面初步探究了miR-19b對神經(jīng)細胞損傷的保護作用及可能機制，接下來將進一步通過動物實驗驗證miR-19b對神經(jīng)細胞損傷的保護作用及其他調(diào)控通路。

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（本文編輯 于國藝）