危夢(mèng)，劉文龍，鄒強(qiáng)，周衡剛，邵良偉，劉達(dá)玉*

1.成都大學(xué)肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610106）；2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心（廣州 510730）

豆豉的后發(fā)酵過(guò)程是形成豆豉獨(dú)特風(fēng)味和各種功能因子的關(guān)鍵步驟[1]。豆豉發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)等水解生成的氨基酸、活性肽等物質(zhì)是其風(fēng)味的主要來(lái)源。豆豉后發(fā)酵工藝過(guò)程，對(duì)豆豉中有機(jī)酸、醇類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)等化合物的形成有較大影響[2]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵的毛霉型豆豉后發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，一般要至少發(fā)酵1年以上，因此其風(fēng)味往往比快速發(fā)酵的豆豉要好。目前工業(yè)上為了縮短生產(chǎn)周期，采用的是提高后發(fā)酵溫度，通過(guò)高溫加速各種生化反應(yīng)的速度來(lái)達(dá)到縮短發(fā)酵時(shí)間的目的，但是會(huì)對(duì)風(fēng)味造成一定影響。在后發(fā)酵過(guò)程中，適當(dāng)?shù)纳郎乜梢允姑阜磻?yīng)加速，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，因酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，反而效果不佳[3]。

試驗(yàn)以在潼川傳統(tǒng)毛霉型豆豉后發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)適當(dāng)升溫縮短發(fā)酵時(shí)間和添加乳酸菌以及酵母菌來(lái)強(qiáng)化后發(fā)酵工藝[4]。乳酸菌生長(zhǎng)繁殖后，可以產(chǎn)生有機(jī)酸，利于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)生成的乳酸又能與醇類(lèi)合成酯及香氣成分的前體物質(zhì)。酵母菌可利用豆豉中的還原糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵己糖生成醇類(lèi)物質(zhì)，結(jié)合豆豉中產(chǎn)生的有機(jī)酸還可生成酯類(lèi)物質(zhì)，從而賦予豆豉醇的香氣和加速產(chǎn)品后熟[5]。

1 材料與方法

1.1 原輔料與試劑

黃豆，市售。毛霉菌種，由四川省成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程給學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

成熟豆豉曲：由制曲工藝（菌粉接種量0.21%、制曲溫度17 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d、制曲相對(duì)濕度86% RH）制得；乳酸菌：此次試驗(yàn)使用的發(fā)酵乳桿菌是發(fā)酵乳酸菌的異形發(fā)酵、乳糖代謝、半乳糖等多種糖類(lèi)，生成乳酸、醋酸、琥珀酸、乙醇等代謝產(chǎn)品。魯氏酵母AS2.371：具有耐鹽的特點(diǎn)，能在食鹽含量低于18%的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖良好，具有增香的功能；食用鹽：精純鹽；白酒：選用低度白酒；醪糟：選用四川東柳醪糟有限責(zé)任公司生產(chǎn)的東柳醪糟。

氫氧化鈉、37%甲醛、硫酸銨、丙三醇、硫酸銅、無(wú)水乙酸鈉、硫酸鉀等，均為國(guó)產(chǎn)分析純；MRS培養(yǎng)基，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GNP-9160隔水式智能恒溫培養(yǎng)箱，常州雙瑞儀器制造有限公司；SH-020恒溫恒濕試驗(yàn)箱，上海上器集團(tuán)試驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-2 pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HSU-80手持鹽度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；KDN-102C凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；JA3103N電子分析天平，上海民橋精密儀器科學(xué)有限公司；WXL-30W臺(tái)稱(chēng)，瑞安市浩展衡器有限公司；DL-2萬(wàn)用電爐，北京中興韋業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)工藝參數(shù)的確定

在潼川傳統(tǒng)毛霉型豆豉后發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)適當(dāng)升溫縮短發(fā)酵時(shí)間和添加乳酸菌和酵母菌來(lái)強(qiáng)化發(fā)酵，以氨基態(tài)氮含量和總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同的食鹽添加量、發(fā)酵溫度、乳酸菌和酵母菌接種比例、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)豆豉成品氨基態(tài)氮含量和總酸含量的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，以此來(lái)確定后發(fā)酵工藝的最佳條件[6]。

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，研究食鹽添加量、發(fā)酵溫度、乳酸菌和酵母菌接種比例、發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆豉質(zhì)量的影響，以氨態(tài)氮含量和總酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最適合的發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.2 豆豉理化指標(biāo)測(cè)定

食鹽含量的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.44—2016的直接滴定法測(cè)定食鹽含量；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：根據(jù)GB/T 5009.5—2016凱氏定氮法測(cè)定豆豉中的蛋白質(zhì)含量；氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.235—2016進(jìn)行；總酸含量的測(cè)量：根據(jù)SB/T 10170—2007進(jìn)行；水分的測(cè)定：根據(jù)GB/T 62846—2016進(jìn)行。

1.3.3 感官指標(biāo)

由10名感覺(jué)評(píng)價(jià)員組成評(píng)價(jià)小組，按照T/GZSX 014—2018豆豉規(guī)格的感官指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示。

表2 毛霉型豆豉的感官評(píng)定結(jié)果

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)得到的最佳發(fā)酵工藝，在此條件下分別用5.00 kg（4組平行）豉曲進(jìn)行豆豉后發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵結(jié)束的毛霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 后發(fā)酵工藝單因素的試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 食鹽添加量的確定

在豆豉后發(fā)酵過(guò)程中，食鹽的添加可有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，能達(dá)到抑菌防腐的目的[7-8]。試驗(yàn)選用豉曲按確定的制曲條件（菌粉接種量0.21%、制曲溫度17 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d、制曲相對(duì)濕度86% RH）處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時(shí)分別加入6.00%，7.50%，9.00%，10.50%和12.00%的食鹽（每組試驗(yàn)3個(gè)平行），3.00%的醪糟酒，2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時(shí)加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2.00%，接種比例為1∶2），溫度35 ℃條件下發(fā)酵60 d，測(cè)定此時(shí)豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳食鹽添加量。

圖1為食鹽添加量對(duì)氨基態(tài)氮和總酸含量的影響研究結(jié)果。結(jié)果表明，當(dāng)食鹽添加量為9.00%時(shí)，最終產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量最大；當(dāng)鹽濃度高于9.00%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量顯著降低（p＜0.05）；當(dāng)鹽濃度高于10.00%時(shí)，總酸含量顯著降低（p＜0.05），原因可能是低濃度時(shí)，豉曲中的蛋白酶受到鹽的抑制作用較小，隨著鹽濃度的增加，微生物的生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響酶系物質(zhì)的活力，造成豉曲中分解產(chǎn)生的氨基酸等有機(jī)酸含量的減少，使得氨基酸態(tài)氮含量降低，對(duì)應(yīng)的總酸含量也呈降低趨勢(shì)。

圖1 食鹽添加量對(duì)氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定

豆豉后發(fā)酵過(guò)程是大豆中的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)等在相應(yīng)酵素的作用下生成氨基酸等物質(zhì)的催化反應(yīng)，溫度過(guò)低對(duì)催化反應(yīng)的進(jìn)行不利，溫度過(guò)高又會(huì)影響酶系統(tǒng)的活性，蛋白質(zhì)的分解能力變?nèi)鮗9-10]。試驗(yàn)選用豉曲按確定的制曲條件處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時(shí)加入9.00%的食鹽、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時(shí)加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2%，接種比例為1∶2），在不同溫度（30，32，34，36和38 ℃，每組試驗(yàn)3個(gè)平行）條件下發(fā)酵60 d，測(cè)定此時(shí)豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

由圖2可知，當(dāng)溫度為35 ℃左右時(shí)，最終產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮和總酸含量為最高，而溫度繼續(xù)升高，會(huì)導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮和總酸含量降低。由于溫度在35 ℃左右時(shí)蛋白酶活最高，蛋白酶活力高則分解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)，豆豉中氨基態(tài)氮含量也對(duì)應(yīng)升高，總酸含量也相應(yīng)升高。因此，發(fā)酵溫度選擇在35 ℃左右。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.1.3 乳酸菌和酵母菌接種比例的確定

乳酸菌產(chǎn)生的乳酸可以降低體系pH，促進(jìn)酵母的繁殖。酵母菌在代謝過(guò)程中，不僅通過(guò)自身分解酶系水解淀粉成己糖，而且還可通過(guò)EMP途徑、無(wú)氧呼吸發(fā)酵產(chǎn)生酒精、甘油、糠醇、琥珀酸等物質(zhì)，酒精也可以代謝成有機(jī)酸，或與有機(jī)酸等反應(yīng)生成酯，這些物質(zhì)都成為豆豉品香的重要來(lái)源[11]。試驗(yàn)選用豉曲按確定的制曲條件處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時(shí)加入9.00%的食鹽、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時(shí)加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2.00%），乳酸菌和酵母菌比例分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3（每組試驗(yàn)3個(gè)平行），在溫度35 ℃條件下發(fā)酵60 d，測(cè)定此時(shí)豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳接種比例。

為了充分發(fā)揮乳酸菌和酵母菌對(duì)豆豉發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，試驗(yàn)優(yōu)先接種乳酸菌，然后在間隔30 d時(shí)，再接種酵母菌，兩種菌總的接種量為2.00%。探究?jī)煞N菌的最佳接種比例，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)接種比例為1∶2左右時(shí)，豆豉成品中的氨基酸態(tài)氮和總酸含量均為最多。因此，后續(xù)正交試驗(yàn)考慮接種比例在1∶2左右。

圖3 接種比例對(duì)氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

試驗(yàn)選用豉曲按確定的制曲條件處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時(shí)加入9.00%的食鹽、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時(shí)加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2.00%，接種比例為1∶2），在溫度35 ℃條件下分別發(fā)酵45，52，59，66和72 d，測(cè)定此時(shí)豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

從圖4可以看到，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，氨基酸態(tài)氮的含量和總酸含量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵超過(guò)60 d時(shí)，氨基氮的含量緩慢增加而穩(wěn)定，有稍稍減少的傾向，但是發(fā)酵超過(guò)60 d，總酸含量顯著下降（p＜ 0.05），此時(shí)豆豉已發(fā)酵成熟。后發(fā)酵前期，由于在制曲階段積累的蛋白酶等酶的活性高，所生成的有機(jī)酸還沒(méi)有積蓄，所以抑制酶活性弱，蛋白質(zhì)通過(guò)各種酵素的協(xié)調(diào)作用被分解為小分子的氮化化合物，氨基酸態(tài)氮雖然快速積累，但后發(fā)酵后期有機(jī)酸的大量增加，抑制了酶活性，激活了氨基酸。酸態(tài)氮含量的增加幅度變?nèi)?，最后趨于穩(wěn)定[12]?？偹岬暮侩S著游離氨基酸和有機(jī)酸的累積一直呈上升趨勢(shì)，酸度達(dá)到一定程度后，會(huì)反過(guò)來(lái)抑制酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致分解的氨基酸降低[13]。因此，后續(xù)正交試驗(yàn)考慮發(fā)酵時(shí)間在60 d左右。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.2 優(yōu)化工藝條件下毛霉型豆豉成品質(zhì)量檢測(cè)

2.2.1 毛霉型豆豉成品質(zhì)量檢測(cè)

為保證優(yōu)化工藝條件下生產(chǎn)的毛霉型豆豉的質(zhì)量，檢驗(yàn)按照優(yōu)化工藝發(fā)酵的豆豉成品是否符合標(biāo)準(zhǔn)，以T/GZSX 014—2018豆豉標(biāo)準(zhǔn)為參考，對(duì)此次試驗(yàn)的毛霉型豆豉進(jìn)行成品質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示所有指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 毛霉型豆豉產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)對(duì)照表

2.3 后發(fā)酵工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，確定豆豉最佳后發(fā)酵條工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

從正交試驗(yàn)的結(jié)果和方差分析的結(jié)果可以看出，影響氨基酸狀態(tài)氮的主要因素次序?yàn)镈＞B＞A＞C，影響總酸含量的主要因素次序?yàn)锽＞A＞D＞C。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆豉氨基酸狀態(tài)氮的含量有著極顯著的影響（p＜0.01）。食鹽的添加量、乳酸菌和酵母菌的接種比例對(duì)氨基酸狀態(tài)氮含量有著顯著的影響（0.01＜p＜0.05）。食鹽添加量、發(fā)酵溫度及時(shí)間對(duì)豆豉總酸含量有極為顯著的影響，乳酸菌和酵母菌的接種比例對(duì)總酸含量有顯著的影響[14]?？疾旄饕蛩氐臉O差Rj值，分別確定影響兩個(gè)指標(biāo)因素的主次順序，同時(shí)結(jié)合水平結(jié)果平均值Kij確定兩指標(biāo)下的最優(yōu)因素組合；針對(duì)氨基酸態(tài)氮，最佳因素組合為A2B2C1D2；針對(duì)總酸含量，最佳因素組合為A1B3C2D2。考慮到試驗(yàn)是為了探究相關(guān)因素對(duì)最終產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的影響，綜合平衡選擇發(fā)酵的最佳組合為A2B3C1D2，即食鹽添加量9.00%，發(fā)酵溫度36 ℃，乳酸菌和酵母菌接種比例1∶1，發(fā)酵時(shí)間60 d。在此組合下發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮為0.93 g/100 g左右，總酸含量為2.08 g/100 g左右。

表4 發(fā)酵條件L9(34)正交試驗(yàn)表

接表4

表5 方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出豆豉后發(fā)酵最佳工藝條件：食鹽添加量9.00%，發(fā)酵溫度36 ℃，乳酸菌和酵母菌接種比例1∶1，發(fā)酵時(shí)間60 d。在此條件下分別用5.00 kg（4組平行）豉曲進(jìn)行后發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵結(jié)束的毛霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量進(jìn)行檢測(cè)。4組豆豉成品氨基酸態(tài)氮含量平均值為0.95 g/100 g，與理論值0.93 g/100 g相差0.02 g/100 g；總酸含量平均值為2.02 g/100 g，與理論值相差0.06 g/100 g，表明在此優(yōu)化條件下發(fā)酵生產(chǎn)的豆豉方法可靠、質(zhì)量穩(wěn)定。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以潼川傳統(tǒng)的毛霉型豆豉后發(fā)酵過(guò)程為基礎(chǔ)，把氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討毛霉型豆豉后發(fā)酵過(guò)程中的食鹽添加量、發(fā)酵溫度、乳酸菌和酵母菌接種比例、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)氨基態(tài)氮含量和總酸含量的影響。并利用正交試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵工藝，在此條件下分別用5.00 kg（4組平行）豉曲進(jìn)行豆豉后發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵結(jié)束的毛霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。從正交試驗(yàn)的結(jié)果和方差分析的結(jié)果可以看出，影響氨基酸狀態(tài)氮的主要因素次序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞食鹽添加量＞接種比例；影響總酸含量的主要因素次序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞食鹽添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞接種比例。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為食鹽添加量9.00%、發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時(shí)間60 d、乳酸菌和酵母菌接種比例1∶1。在此組合下發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮在0.93 g/100 g左右，總酸含量在2.08 g/100 g左右。該研究可為今后霉型豆豉的后發(fā)酵工藝提供一定技術(shù)指導(dǎo)。