于學娟，李銀塔 ，劉榮，彭昌盛，王韶華，東莎莎

1.煙臺職業(yè)學院（煙臺 264000）；2.威海海洋職業(yè)學院（榮成 264300）；3.中國海洋大學（青島 266100）；4.榮成市綜合技術轉化中心（榮成 264300）；5.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院（濟南 250014）

金槍魚是世界上主要的魚類資源之一，具有較高經(jīng)濟價值，也是被國際營養(yǎng)協(xié)會推薦的綠色無污染健康美食[1-2]。金槍魚富含豐富的優(yōu)質蛋白質、維生素、脂肪等，尤其富含DHA和EPA，具有很高的營養(yǎng)價值，還可以改善記憶、促進大腦發(fā)育等[3]，因此被加工成各類食品。

對于金槍魚的加工大部分集中在生魚片和罐頭類食品[4]，但是加工利用率較低，利用率只有30%～50%，伴隨產(chǎn)生50%～70%的副產(chǎn)物[1]。金槍魚副產(chǎn)物中富含大量的優(yōu)質蛋白質、DHA和EPA等高營養(yǎng)價值成分，若丟棄則造成嚴重資源浪費，因此迫切需要將金槍魚加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物進一步開發(fā)利用。

對水產(chǎn)品副產(chǎn)物的開發(fā)，大部分研究都集中在采用酶法和發(fā)酵法，其中酶解的生產(chǎn)工藝操作簡單，但是卻無法消除水產(chǎn)品的腥味，并且加工產(chǎn)物容易變質、難于儲存，市場接受度較低[3,5-13]；發(fā)酵工藝可生成抗菌作用的活性肽，可使加工產(chǎn)物去腥，還可延長保質期[14-21]，但是以發(fā)酵工藝加工金槍魚副產(chǎn)物的研究卻很少。試驗使用金槍魚下腳料，以水解度為指標，利用納豆菌和枯草芽孢桿菌進行雙菌液態(tài)發(fā)酵工藝研究，通過考察單因素試驗和響應面（RSM）設計[10,17,22-24]對雙菌（納豆菌和枯草芽孢桿菌）發(fā)酵條件進行優(yōu)化并進行相關分析，確定發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。利用最佳發(fā)酵工藝制備的發(fā)酵液生產(chǎn)防腐功能海鮮風味調料，并采用高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）聯(lián)用儀分析其主要成分，為金槍魚下腳料的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚（山東榮成市售）；枯草芽孢桿菌、納豆菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院）；乙腈（美國Fisher Scientific公司）。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Access HPLC/MS聯(lián)用儀（美國Thermo公司）；UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津）；L-8900全自動氨基酸分析儀（AAA，日本HITACHI公司）。

1.3 試驗內容

1.3.1 金槍魚下腳料制備

取金槍魚去除內臟和魚皮的金槍魚下腳料，清洗并絞碎備用。

1.3.2 菌株活化及生產(chǎn)菌液制備

取甘油封存的納豆芽孢桿菌菌種，采用平板劃線法接種到BPY培養(yǎng)基上，在37 ℃進行24 h倒置培養(yǎng)；將其接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，靜置培養(yǎng)，24 h活化完成；將活化后的納豆菌接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃、搖床頻率120 r/min培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液的OD630nm1.2～2.0即得到生產(chǎn)菌液。

取枯草芽孢桿菌凍干粉，將其溶于營養(yǎng)瓊脂/肉汁培養(yǎng)基，采用涂布法接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃進行24 h倒置培養(yǎng)即得活化的枯草芽孢桿菌；將活化后的菌接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃、搖床頻率150 r/min培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液的OD630nm1.5～2.5即得到生產(chǎn)菌液。

1.3.3 雙菌發(fā)酵工藝和響應面試驗設計

1.3.3.1 雙酶發(fā)酵制備防腐功能海鮮風味調料的工藝流程

將金槍魚下腳料、麩皮和葡萄糖按15∶4∶1混勻作為發(fā)酵基質，裝入錐形瓶中，加入一定量水，在121 ℃滅菌20 min，冷卻至30 ℃；接入納豆菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌液（1∶1，V/V），置于40 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，期間每隔4 h攪拌1次，72 h后發(fā)酵完成；發(fā)酵終產(chǎn)物經(jīng)過濾，獲得防腐功能海鮮風味調料。

1.3.3.2 基質水分對雙菌發(fā)酵的影響

分別調節(jié)基質水分80%，85%，90%，95%，100%和105%，在初始pH 7.5、接種量0.15 mL/g、發(fā)酵溫度40 ℃條件下，進行雙菌發(fā)酵72 h，研究基質水分對雙菌發(fā)酵的影響。

1.3.3.3 接種量對雙菌發(fā)酵的影響

分別調節(jié)接種量0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 mL/g，在基質水分90%，初始pH 7.5，發(fā)酵溫度40 ℃條件下，發(fā)酵72 h，探討接種量對雙菌發(fā)酵的影響。

1.3.3.4 pH對雙菌發(fā)酵的影響

分別調節(jié)pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5，在基質水分90%，接種量0.15 mL/g，發(fā)酵溫度40 ℃時，發(fā)酵72 h，研究pH對雙菌發(fā)酵的影響。

1.3.3.5 發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵的影響

分別設置發(fā)酵溫度30，35，40，45和50 ℃，在基質水分90%，初始pH 7.5，接種量0.15 mL/g時，研究發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵的影響。

1.3.3.6 發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵的影響

分別設置發(fā)酵48，60，72，84和96 h，在基質水分90%，初始pH 7.5，接種量0.15 mL/g，溫度40 ℃時，測定水解度，研究發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵的影響。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物檢測分析

1.3.4.1 肽類成分分析的色譜條件

對發(fā)酵后的產(chǎn)物采用張寧等[14]的方法分析抗菌脂肽成分，色譜柱采用氰柱Venusil XBP CN（100 mm× 2.1 mm，5 μm）；流動相A為乙腈；流動相B為含0.1%甲酸的乙酸銨溶液（5 mmol/L）；流速300 μL/min；梯度洗脫過程為A 40%和B 60%；質譜條件維持不變。

采用左愛華等[26]的方法分析蛋白肽成分，色譜柱采用C18（75 μm×15 cm，3 μm，100 ?）；流動相采用0.1%甲酸水（A）、乙腈（含0.1%甲酸，B）；梯度洗脫過程為10%～30% B，90～103 min；流速300 nL/min；質譜條件維持不變。

1.3.4.2 AAA檢測條件[27]

分離柱采用4.6 mm×60 mm（陽離子交換樹脂）；柱溫57 ℃，進樣量20 μL，緩沖液流速0.35 mL/min；茚三酮反應液采用流速0.35 mL/min、溫度135 ℃；數(shù)據(jù)分析用自帶軟件。

1.3.4.3 水解度

在制備發(fā)酵基質前，準確稱取金槍魚下腳料質量，記為X；發(fā)酵后，用水漂除麩皮，使用低速離心機離心收集不溶物并稱質量，記為Z。水解度計算如式（1）。

式中：Y為金槍魚下腳料水解度，%；X為初始金槍魚下腳料質量，g；Z為發(fā)酵后金槍魚下腳料剩余質量，g。

2 結果與分析

2.1 雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料工藝單因素試驗結果與分析

2.1.1 基質水分對雙菌發(fā)酵的影響

隨著基質水分提高，金槍魚下腳料的水解度呈現(xiàn)先增后降趨勢，基質水分90%時，水解度達到最高為39.79%。這可能是因為水分是微生物生長和代謝的決定因素，在基質水分含量較低，雙菌的生長受到抑制，導致次級代謝生成的酶量及其活性不足，而過高的基質水分會阻礙氧氣的傳遞，抑制雙菌呼吸生長，從而限制雙菌的活性和降低酶生成量，因此選擇基質水分90%。

圖1 基質水分對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度影響

2.1.2 接種量對雙菌發(fā)酵的影響

如圖2所示，接種量小于0.15 mL/g時，雙菌接種量增加，水解度隨之增大，接種量0.15 mL/g時水解度42.32%，繼續(xù)增大接種量，水解度基本不變，這可能是因為，隨著接種量增加，菌類數(shù)量增大，產(chǎn)生競爭性抑制，因而影響水解度。因此，選用最適接種量為0.15 mL/g。

圖2 接種量對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度影響

2.1.3 pH對雙菌發(fā)酵的影響

如圖所示，pH顯著影響下腳料的水解度，pH小于7.5時，隨著pH升高，水解度增大，而在pH 7.5時，達到最大，可達44.72%，增大pH，水解度降低。這可能是因為pH影響菌種的活性，過高或者過低的pH會抑制雙菌活性，從而影響金槍魚下腳料的水解度，因此最終選擇pH為7.5。

圖3 初始pH對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵的影響

如圖4所示，發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵的影響較大，在一定范圍內，金槍魚下腳料的水解度隨著發(fā)酵溫度的升高而增大，溫度40 ℃時，水解度達到最大，繼續(xù)升高溫度，水解度反而降低。這可能是因為在適宜的環(huán)境溫度下，菌株生長與代謝旺盛，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物和酶數(shù)量多且活性高，反之，菌株的活性降低導致分泌的酶量不足，難以發(fā)揮蛋白質降解作用，故選擇最佳發(fā)酵溫度40 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度影響

2.1.5 發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵的影響

由圖5可知，發(fā)酵時間對金槍魚下腳料的水解度影響顯著，發(fā)酵時間小于72 h時，水解度隨著發(fā)酵時間的延長而明顯增大，發(fā)酵至72 h時，水解度達到44.72%，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，水解度基本不變。這是因為隨著時間延長，基質中菌和酶的含量逐漸增加，基質不斷被消耗，導致水解度先緩慢增加后急劇提高，而在發(fā)酵后期，產(chǎn)物與基質中底物產(chǎn)生競爭抑制或者產(chǎn)物占據(jù)酶催化部位導致酶失活，水解度達到平衡。因此選擇最佳發(fā)酵時間為72 h。

2.2 防腐功能海鮮風味調料成分分析

2.2.1 氨基酸含量分析

由表1可知，雙菌發(fā)酵產(chǎn)物中有18種氨基酸，總氨基酸含量達99.821 mg/mL，其中，積極呈味氨基酸由表現(xiàn)鮮味[28]的谷氨酸（Glu）和甘氨酸（Gly）、呈現(xiàn)甜味[28]的天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和脯氨酸（Pro）的7種氨基酸構成，其總的含量高達51.213 mg/mL，約占總氨基酸的51.3%，總的必需氨基酸量為37.623 mg/mL，約占總氨基酸的37.69%，表明此調味料具有營養(yǎng)和呈味雙重功效。

圖5 發(fā)酵時間對雙菌發(fā)酵金槍魚下腳料的水解度影響

表1 防腐功能海鮮風味調料中氨基酸組成和含量

2.2.2 蛋白肽成分分析

經(jīng)RSM優(yōu)化制備的金槍魚下腳料蛋白肽用HPLCMS分析測定[29]，結果見表2，蛋白肽分子質量均小于5 000 Da，且分子質量主要集中在247～741 Da，約占總蛋白肽比例為77.239%。根據(jù)現(xiàn)有蛋白肽的國家標準[30-31]，試驗產(chǎn)品為優(yōu)質低聚肽，因而制備的調味料具有很高的應用價值。

2.2.3 脂肽成分分析

按照孫力軍等[31-32]測定脂肽的方法，對試驗雙菌發(fā)酵的調味料進行脂肽分析，結果見表3。脂肽的分子質量主要集中在971.9～1 497.3 Da，根據(jù)分子質量的差值（相差14或14的倍數(shù)）情況可分為3組：1 497.3，1 483.3，1 470.1，1 469.3；1 048.6，1 034.8，1 020.8；1 057.8，1 043.4，1 028.8，1 014.4，1 000.2，986.3，971.9 Da。此類情況體現(xiàn)脂肪酸鏈相差nCH2或氨基酸鏈上Val和Ala（分子質量差28 Da）或Leu和Val（分子質量差14 Da）互相取代等脂肽結構的特征[31]。張寧等[14]研究報道的抗菌脂肽情況，雙菌發(fā)酵的調味料中脂肽為Iturins、Fengycins和Surfactins 3種類型，3種脂肽具有良好的光譜抗菌作用，賦予調味料天然防腐功效。

表2 金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵蛋白肽的分子質量分布

表3 金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵脂肽的分子質量分布

3 結論

以金槍魚下腳料為基礎通過雙菌發(fā)酵制備調味料，通過研究基質水分、雙菌接種量、pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對調味料水解度的影響，優(yōu)化制備工藝，通過條件優(yōu)化所得最佳工藝參數(shù)為：基質水分90%，初始pH 7.5、接種量0.15 mL/g、發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時間72 h。利用HPLC-MS對金槍魚下腳料雙菌發(fā)酵產(chǎn)物進行成分分析，雙菌發(fā)酵產(chǎn)物包括小分子肽（分子質量247～741 Da），約占總肽量的77.239%；18種氨基酸，其中積極呈味氨基酸占總氨基酸的51.3%；生成Iturins、Fengycins和Surfactins這3種抗菌脂肽，因而雙菌發(fā)酵產(chǎn)物具有很高鮮味和營養(yǎng)且能夠防腐，其可作為調味料應用。