黃小燕，蘇琪盛，丘程程，朱尚勇

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，廣西 南寧 530021）

0 引言

子宮內(nèi)膜癌(UCEC)是女性三大婦科惡性腫瘤之一。近10年，UCEC的死亡率年增長率約1.4%，其發(fā)病率逐漸上升[1]。子宮及雙側(cè)附件切除是UCEC的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，對于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，輔以放、化療及激素治療，這些治療手段給患者創(chuàng)傷性大。分子靶向治療因其創(chuàng)傷小、療效優(yōu)的特點，成為有效的UCEC治療策略。因此，鑒別UCEC特異的分子標(biāo)志物實現(xiàn)分子靶向治療尤顯重要[2]。然而，由于對UCEC的組織病理學(xué)分類和異質(zhì)性認(rèn)識不足，識別其分子生物標(biāo)記物仍具挑戰(zhàn)。

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤中具有自我更新、高增殖和多向分化潛能的一類細(xì)胞，具有促腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的作用[3]。CSCs的干性與多數(shù)癌癥的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性相關(guān)。腫瘤內(nèi)異質(zhì)性包含細(xì)胞表面標(biāo)記物及表型異常，而細(xì)胞表面標(biāo)記物以及基因突變類型常被認(rèn)為是腫瘤病理分類和治療的依據(jù)[4]。有研究表明UCEC的發(fā)生與CSCs的干性有關(guān)[5]。本研究著重于從CSCs干性特征的角度識別與UCEC的組織病理學(xué)分類和異質(zhì)性相關(guān)的特征基因。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

UCEC患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）組織病理學(xué)證實為原發(fā)性UCEC患者;（2）完整RNA-Seq數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)的患者（如年齡，病理分級、生存時間）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非原發(fā)性UCEC患者;（2）臨床資料不完整。本研究納入23個正常子宮內(nèi)膜組樣本及552個UCEC樣本。

1.2 mRNAsi與UCEC的臨床病理的相關(guān)性

mRNAsi用于評估腫瘤細(xì)胞的去分化程度，mRNAsi值經(jīng)過1類邏輯回歸機(jī)器學(xué)算法得到[3]，其值的區(qū)間為[0，1]，值越趨近于1，則表示腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞的相似程度越大。根據(jù)腫瘤樣本的mRNAsi的中位數(shù)將患者分為高mRNAsi組與低mRNAsi組，并通過R語言中的“survival”包進(jìn)行生存分析。Wilcoxon秩和檢驗分析UCEC病理分級與不同年齡間mRNAsi值的差異。最后采用R語言中的“beeswarm”包進(jìn)行結(jié)果可視化處理。

1.3 UCEC中的差異表達(dá)基因分析

通過Wilcoxon秩和檢驗篩選樣本的差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)：假陽性率(FDR)＜0.05及|log2(FC)|≥1。FC為樣本表達(dá)量的差異倍數(shù)。

1.4 WGCNA模型構(gòu)建與模塊篩選

運(yùn)用R語言中的“WGCNA”包構(gòu)建具有近似無尺度特性的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA），篩選與腫瘤干細(xì)胞高度相關(guān)的模塊[6]。通過hclust函數(shù)對樣本進(jìn)行聚類分析，使用pickSoftThreshold函數(shù)確定軟閾值，設(shè)定模塊中最小基因數(shù)為30，切割高度的閾值為0.25，采用拓?fù)渲丿B（TOM）計算，并運(yùn)用動態(tài)切割法識別共表達(dá)基因模塊[7]，構(gòu)建模塊樹狀圖。

1.5 樞紐基因的篩選

選擇與臨床性狀相關(guān)性最高的模塊，計算模塊內(nèi)每個基因的基因顯著性（GS）與模塊隸屬度（MM）的相關(guān)性，設(shè)定篩選模塊內(nèi)關(guān)鍵基因的閾值為MM＞0.8，GS＞0.5。

1.6 GO、KEGG富集分析及蛋白質(zhì)（PPI）網(wǎng)絡(luò)互作分析

GO和KEGG分析對關(guān)鍵基因行功能注釋及通路富集[8]，采用“clusterProfiler”包進(jìn)行富集分析。當(dāng)FDR＜0.05時，認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過在線工具STRING（https://www.string-db.org/)[9]進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析（PPI），并用Cytoscape軟件實現(xiàn)可視化[10]。PPI中關(guān)鍵節(jié)點的篩選閾值為最低篩選分?jǐn)?shù)≥0.8。以節(jié)點數(shù)最高的基因作為樞紐基因。

1.7 統(tǒng)計分析

運(yùn)用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 mRNAsi與臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

與正常子宮內(nèi)膜組比較，腫瘤組的mRNAsi表達(dá)量與UCEC患者的病理分級及年齡（以65歲為界）成正相關(guān)（P＜0.001）（圖1A 和 B）。

圖1 mRNAsi與UCEC患者臨床病理分級及年齡的相關(guān)性

2.2 差異基因篩選

在TCGA數(shù)據(jù)庫中得到575個樣本（包括552個UCEC組及23個正常組），篩選出6267個差異表達(dá)基因，包括2406個下調(diào)基因和3861個上調(diào)基因（圖2）。

圖2 差異基因的篩選：紅色基因代表在樣本中上調(diào)的基因，綠色表示下調(diào)的基因

2.3 WGCNA篩選關(guān)鍵模塊與基因

根據(jù)“WGCNA”包對樣本行聚類分析獲得16個關(guān)鍵模塊。為了保證無尺度網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性，其篩選的軟閾值為4（R2=0.95）（圖3A）。通過動態(tài)剪切樹算法分割模塊，形成模塊樹狀圖（圖3B），計算16個模塊內(nèi)的基因與mRNAsi及表觀調(diào)控的mRNAsi（EREG-mRNAsi）的相關(guān)性，其中藍(lán)綠色模塊與mRNAsi呈明顯的正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高（圖3C，r=0.70,P=4e-80），棕色模塊與mRNAsi呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.55,P=2e-42）。因此，我們選擇藍(lán)綠色模塊進(jìn)行分析篩選得到關(guān)鍵基因（圖3D）。以 MM＞0.8，GS＞0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到 44個與腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)的基因（P＜0.01），這些基因在UCEC組中上調(diào)（圖4A，B）。在這44個基因的相關(guān)性分析結(jié)果中，DEPDC1和CENPI及CENPE 的相關(guān)性最高(r=0.87)（圖4C）。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析

對44個基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理，節(jié)點數(shù)最多的10個基因為TTK、NCAPH、NCAPG、KIF15、KIF11、CDCA8、CCNB1、CCNA2、BUB1B 和 BUB1（圖5）。GO和KEGG功能富集分析得到關(guān)鍵基因主要富集于細(xì)胞周期調(diào)控，有絲分裂姐妹染色單體分離，同源重組修復(fù)等通路（圖6）。

3 討論

在多種癌癥組織中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可表現(xiàn)出與干細(xì)胞特性相似的生物學(xué)功能，包括：（1）自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制；（2）腫瘤細(xì)胞可能來源于正常干細(xì)胞[11]。并且有研究表明腫瘤組織中存在小部分具有無限增殖能力的腫瘤干細(xì)胞（CSCs）群體[12]。在概念上提出干細(xì)胞樣癌細(xì)胞的數(shù)年后，學(xué)者首次在白血病模型中證實CD34+CD38-白血病細(xì)胞表現(xiàn)出骨髓造血干細(xì)胞特征[13]。同時實體瘤內(nèi)的CSCs（CD44+CD24-/lowLineage-細(xì)胞）已在乳腺癌、腦、結(jié)腸、胰腺、肝和肺癌中發(fā)現(xiàn)。因此，CD34+,CD44+被認(rèn)為是在癌癥組織中獨特的CSCs標(biāo)記物[14]。

圖3 關(guān)鍵模塊的篩選

圖4 藍(lán)綠色模塊中的差異基因篩選及基因間的相關(guān)性分析

圖5 10個樞紐基因的篩選：44個關(guān)鍵基因的PPI圖，及10個樞紐基因的PPI圖

圖6 GO和KEGG分析

本研究采用WGCNA篩選出的10個樞紐基因參與了多種腫瘤的發(fā)生，其功能主要富集在有絲分裂核分裂、核染色體分離、紡錘體檢查點功能和同源重組修復(fù)通路中，這與多位學(xué)者的研究結(jié)果一致[15]。Mps1(TTK)的表達(dá)水平降低導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的有絲分裂異常[16]。CDCA5和CDCA8表達(dá)異常影響了細(xì)胞核的分裂，主要參與膀胱癌的細(xì)胞周期過程[17]。Imai T等人的研究表明，KIF11在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和結(jié)直腸癌(CRC)組織中的CSCs里發(fā)揮著重要作用[18]。HuiCai等人的研究報道CCNB1通過調(diào)控細(xì)胞周期來影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險[19]，此外，在腦癌CSCs中，CCNB1和BUB1B可影響與有絲分裂和紡錘體檢查點功能有關(guān)的蛋白分泌，從而調(diào)控CSCs的增殖[20]。然而，這10個樞紐基因與UCEC中CSCs的干性特征的關(guān)系尚未明確。本次研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的失調(diào)可能與UCEC中CSCs的干性特征有關(guān)。

4 結(jié)論

CSCs位于腫瘤細(xì)胞層級的頂端，并具有建立和驅(qū)動腫瘤發(fā)生的獨特能力。我們通過WGCNA分析獲得了與UCEC干性特征相關(guān)的樞紐基因（即TTK、NCAPH、NCAPG、KIF15、KIF11、CDCA8、CCNB1、CCNA2、BUB1B 和 BUB1）。而這些基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起著至關(guān)重要的作用，可能影響UCEC的干細(xì)胞維持。因此，我們的研究有助于深入理解UCEC的分子機(jī)制，我們獲得的這10個樞紐基因可能為研究靶向治療UCEC的治療靶點提供參考。