蘇 丹，楊智遠(yuǎn)，孫 蕊，張文浩，孫曉東，呂國忠**

（1.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110044；2.大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；3.大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600）

蛹蟲草（Cordyceps militaris） 又可稱之為北蟲草、蛹草菌等，隸屬于真菌門（Eumycota） 于囊菌亞門 （Ascomycotina） 核菌綱 （Pyrenomycete） 麥角菌科（Clavicipitaceae） 蟲草屬（Cordyceps），是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目（Lepidoptera） 夜蛾科（Noctuids） 昆蟲蛹體上形成子座與蛹體的結(jié)合體[1]。野生蛹蟲草的下部為蟲身，上部為子實體。蛹蟲草食用、藥用價值很高，其蛋白質(zhì)含量極為豐富，飽和脂肪酸如亞油酸含量較高，還含有豐富的礦物質(zhì)元素、各種維生素、蟲草素、蟲草多糖等物質(zhì)[2]，具有降低血脂、促進腸胃運動，幫助消化、預(yù)防血栓形成和動脈血管僵化、增強免疫力和抗炎等功效[2]。采用液體深層發(fā)酵方式培養(yǎng)，流動性大、培養(yǎng)條件較易人工調(diào)控、菌種生長繁殖快、生產(chǎn)成本較低、周期較短、可規(guī)模化量產(chǎn)等優(yōu)勢，具有很好的商業(yè)價值和廣闊的市場空間[3]。雖然關(guān)于蛹蟲草人工栽培的研究報道很多，但液體深層發(fā)酵的具體方式和條件不一，依然處在深化研究階段，還需要大量的試驗數(shù)據(jù)驗證其可行性。通過對蛹蟲草發(fā)酵相關(guān)資料進行分析，在前人研究蛹蟲草發(fā)酵優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，以蛹蟲草二級試驗菌種為原材料，進行蛹蟲草發(fā)酵條件優(yōu)化研究，篩選出最適合蛹蟲草菌種繁殖生長的培養(yǎng)條件，以期為蛹蟲草規(guī)?；a(chǎn)及蛹蟲草的相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

上虞艾科LDX-30KBS高壓蒸汽滅菌鍋；上海雙舜TG12M離心機；沈陽龍騰JD-4電子天平；托普云農(nóng)GTOP-260B恒溫培養(yǎng)箱；智城分析ZHJHC1109C超凈工作臺；安慶潔佳LZ-9200ZH電熱干燥箱；上海晶壇SG-8020E振蕩培養(yǎng)箱。

1.1.2 試驗材料

蛹蟲草二級試驗菌種，為遼寧省微生物科學(xué)研究所提供。

1.1.3 藥品試劑

磷酸氫二鉀、葡萄糖、75%乙醇、維生素B1、氯化銨、蔗糖、硫酸鎂等均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

改良PDA培養(yǎng)基：土豆20%、MgSO40.1%、瓊脂1.5%、蛋白胨0.5%、葡萄糖2%、K2HPO40.2%，蒸餾水1 L。

一級液體培養(yǎng)基：土豆20%、K2HPO40.2%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、MgSO40.1%、VB11片，蒸餾水1 L。

二級液體培養(yǎng)基：蔗糖30%、K2HPO40.2%、MgSO40.1%、蛋白胨1%、VB11片，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 液體菌種的制備

在改良PDA培養(yǎng)基中接種少量蛹蟲草菌絲[5]。轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱中，溫度25℃，倒置避光培養(yǎng)約1周。在超凈工作臺中，挑選生長狀況均勻、擴繁后的菌落，使用打孔器取直徑1 cm、厚度0.2 cm的菌片，接種5片至一級液體培養(yǎng)基中。放入振蕩培養(yǎng)箱中，22℃，150 r·min-1，避光振蕩培養(yǎng)約1周。

1.2.2 單因素試驗

1）pH對菌絲體干重的影響

制作二級液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至6、7、8[6]，分別接種5片直徑1 cm、厚度0.2 cm的菌片至二級液體培養(yǎng)基中，22℃，150 r·min-1，避光振蕩培養(yǎng)。每組設(shè)置3組重復(fù)試驗，分別在第3天、第5天、第7天測定各組菌絲體干重，確定最佳pH。

2）裝液量對菌絲體干重的影響

制作二級液體培養(yǎng)基，選用250 mL三角瓶作為培養(yǎng)瓶。裝液量設(shè)置3組處理，分別為80 mL、100 mL、120 mL。接種5片直徑1 cm、厚度0.2 cm的菌片至二級液體培養(yǎng)基中，22℃，150 r·min-1，避光振蕩培養(yǎng)。每組設(shè)置3組重復(fù)試驗，分別在第3天、第5天、第7天測定各組菌絲體干重，確定最佳裝液量。

3）溫度對菌絲體干重的影響

接種5片直徑1 cm、厚度0.2 cm的菌片至二級液體培養(yǎng)基中，150 r·min-1，避光振蕩培養(yǎng)。分別在18℃、22℃、26℃下振蕩培養(yǎng)1周。每組設(shè)置3組重復(fù)試驗，分別在第3天、第5天、第7天測定各組蛹蟲草菌絲體干重，確定最佳培養(yǎng)溫度。

4）碳源對菌絲體干重的影響

分別以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖為碳源，制作不同碳源的二級液體培養(yǎng)基，通過測定菌絲體干重，考察不同的碳源對菌絲體生長的影響[7]。每種碳源設(shè)置3組重復(fù)試驗，濃度均為20 g·L-1。轉(zhuǎn)速110 r·min-1，20℃，避光培養(yǎng)，分別在第3天、第5天、第7天測定各組蛹蟲草菌絲體干重，確定最佳碳源。

5）氮源對菌絲體干重的影響

分別以蛋白胨、氯化銨、牛肉膏3種物質(zhì)作為的氮源，制作不同氮源的二級液體培養(yǎng)基，通過測定菌絲體的干重，探究3種氮源對液體菌種生長的影響[8]。每種氮源設(shè)置3組重復(fù)試驗，濃度均為1.5 g·L-1，110 r·min-1，20℃，避光培養(yǎng)，分別在第 3天、第5天、第7天測定各組蛹蟲草菌絲體干重，確定最佳氮源。

1.2.3 正交試驗

選擇磷酸氫二鉀和硫酸鎂為無機鹽。根據(jù)單因素試驗結(jié)論，確定最佳碳源、氮源。設(shè)置4因素3水平正交試驗，考察無機鹽、碳源、氮源最佳組合用量[9]。碳源濃度控制在 10 g·L-1～30 g·L-1，變化梯度為 10 g·L-1；氮源濃度控制在 1.5 g·L-1～2.5 g·L-1，變化梯度為 0.5 g·L-1；KH2PO4濃度控制在 0.5 g·L-1～1.5 g·L-1，變化梯度為0.5 g·L-1；硫酸鎂濃度控制在0.1 g·L-1～0.2 g·L-1，變化梯度為0.5 g·L-1[10]。正交試驗設(shè)計表見表1。

表1 正交試驗L9（34）Tab.1 Orthogonal experiment L9（34）

由表1所示，根據(jù)正交表設(shè)置的9組試驗，每組3個重復(fù)。3組平行試驗培養(yǎng)條件為20℃，110 r·min-1，暗培養(yǎng)，分別在第4天、第6天、第8天進行菌絲干重測定。

1.2.4 菌絲干重測定

發(fā)酵液于4 000 r·min-1下離心20 min。過濾收集菌絲體，于60℃下干燥至恒重，并稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 pH對菌絲體干重的影響

pH對菌種的生長至關(guān)重要，過酸過堿都會導(dǎo)致菌種生長緩慢，甚至停止生長[11]。通過pH對菌絲體干重的影響研究，探究菌種液體發(fā)酵的最佳酸堿性條件。pH對蛹蟲草菌絲體生長情況影響見圖1。

圖1 pH對菌絲體干重的影響Fig.1 Influence of pH on dry weight of mycelium

由圖1看出，當(dāng)pH為7時，菌絲體干重最大，說明在該條件下菌絲體生長更快、更多。pH為6或8時，菌絲體干重相對于pH為7時較小，說明在pH為6或8的條件下，菌種生長會受到抑制，生長速度減慢。經(jīng)以上分析得出，液體發(fā)酵培養(yǎng)最佳pH為7。

2.1.2 裝液量對菌絲體干重的影響

菌種的生長以及代謝過程與氧氣息息相關(guān)。裝液量關(guān)聯(lián)著培養(yǎng)瓶中的含氧量，因而菌種的生長狀況也會受到影響。裝液量對蛹蟲草菌絲體干重的影響見圖2。

圖2 裝液量對菌絲體干重的影響Fig.2 Influence of liquid load on dry weight of mycelium

由圖2看出，裝液量為100 mL時，蛹蟲草菌絲干重最大；裝液量為80 mL時，菌絲體干重最小。裝液量適當(dāng)，培養(yǎng)瓶中氧氣充足，培養(yǎng)液中溶氧量多，菌種對氧氣利用率也高。在同一轉(zhuǎn)速下，剪切力隨著裝液量的變化而變化，呈負(fù)相關(guān)，菌絲體生長不均勻；裝液量太多時，培養(yǎng)瓶中氧氣不足，不利于菌種的生長。以上分析可知，250 mL培養(yǎng)瓶進行液體發(fā)酵最佳裝液量為100 mL。

2.1.3 溫度對菌絲體干重的影響

蛹蟲草菌絲體及其內(nèi)重要物質(zhì)的合成依靠酶的催化作用，而酶的活性與溫度密切相關(guān)。溫度對蛹蟲草菌絲體干重的影響見圖3。

圖3 溫度對菌絲體干重的影響Fig.3 Influence of temperature on dry weight of mycelium

由圖3看出，培養(yǎng)溫度為22℃時，所得蛹蟲草菌絲體干重始終最大，在18℃時菌絲體干重最小，不同溫度對菌種的生長產(chǎn)生不同的結(jié)果。溫度過低，菌種活性會降低；溫度過高，菌種生長受到抑制。以上分析可知，液體發(fā)酵最佳溫度為22℃。

2.1.4 碳源對菌絲體干重的影響

碳元素是構(gòu)成生物體最基本的元素，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要物質(zhì)。不同碳源對菌絲體的生長速度、生物量大小、代謝產(chǎn)物的積累等方面產(chǎn)生不同的影響[12]。通過碳源單因素優(yōu)化試驗，測定菌絲體恒重，探究出蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的最佳碳源。碳源對菌絲體干重的影響見圖4。

圖4 碳源對菌絲體干重的影響Fig.4 Influence of carbon source on mycelium dry weight

由圖4可知，不同的碳源對蛹蟲草液體菌種的生長發(fā)育存在顯著差異。蔗糖作為培養(yǎng)基成份時，菌絲體干重最大，為0.716 g；葡萄糖作為碳源時處于中間（0.406 g）；可溶性淀粉為碳源時，菌絲體干重結(jié)果最?。?.290 g）。以上分析得出，以蔗糖作為碳源可以使蛹蟲草菌絲體處于最佳生長環(huán)境，生長繁殖更快，由此選擇蔗糖為最佳碳源。

2.1.5 氮源對菌絲體干重的影響

氮元素是菌絲體生長所需的重要元素。菌種對不同的氮源的利用率不同，其生長也會受到很大的影響。試驗均選用有機氮作為氮源，考察不同氮源對蛹蟲草菌種生長發(fā)育的影響，氮源對蛹蟲草菌絲體干重的影響見圖5。

圖5 氮源對菌絲體干重的影響Fig.5 Influence of nitrogen source on dry weight of mycelium

由圖5可知，應(yīng)用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析得出，蛋白胨均與牛肉膏、氯化銨對蛹蟲草液體菌種的生長發(fā)育存在顯著差異（P＜0.05）。以蛋白胨為氮源時，菌絲體干重最大（0.704 g）；以氯化銨作為氮源時，測定的菌絲體干重最?。?.470 g）；牛肉膏作為氮源時處于中間（0.341 g）。因此由以上分析得出，以蛋白胨作為氮源可促進蛹蟲草菌絲體的生長，產(chǎn)量更多，由此選擇蛋白胨作為最佳氮源。

2.2 四因素三水平正交試驗結(jié)果

采用正交試驗的方法探究最有碳源、氮源、無機鹽的最佳綜合濃度比例。各試驗組菌絲體干重結(jié)果見表2，正交試驗結(jié)果見表3。

表2 正交試驗菌絲體干重Tab.2 Dry weight of mycelium in orthogonal test

培養(yǎng)基中各物質(zhì)使用量不同，菌種的生長會產(chǎn)生相當(dāng)大的差異。由表2可知，由于搖床轉(zhuǎn)速及溫度控制不穩(wěn)定，導(dǎo)致試驗組1結(jié)果與其他2組結(jié)果差異較大，故舍棄第一組數(shù)據(jù)。由試驗組2和試驗組3可得出，試驗組9的菌絲體干重最大，為1.035 g；其次是試驗組7，為1.000 g，菌絲體干重最小的為試驗組1，為0.600 g。由表3可得出，因素A得到的極差值最大，因此蔗糖對蛹蟲草液體發(fā)酵的影響最大。因素D的極差最小，MgSO4對液體菌種生長影響最小。影響程度的順序為：MgSO4＜K2HPO4＜蛋白胨＜蔗糖。以上分析可確定，蛹蟲草液體發(fā)酵的最佳組合為A3B3C2D1，即蔗糖30 g·L-1、蛋白胨2.5 g·L-1、K2HPO41 g·L-1、MgSO40.1 g·L-1，所得菌絲體干重平均值為1.035 g。

表3 正交試驗結(jié)果L9（34）Tab.3 Orthogonal test results L9（34）

3 結(jié)論

通過對蛹蟲草二級菌種進行分離、培養(yǎng)、液體發(fā)酵并篩選出最適宜培養(yǎng)條件以獲得最高的菌絲體干重，應(yīng)用單因素試驗得出最佳pH、裝液量、溫度、碳源和氮源；再采用正交試驗確定了無機鹽、碳源、氮源最佳配方，為蛹蟲草后續(xù)人工培養(yǎng)的開發(fā)研究提供依據(jù)。以蛹蟲草液體培養(yǎng)所得菌絲體干重為指標(biāo)，通過4因素3水平正交試驗結(jié)果，可得出不同因素對蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)影響度的順序為：MgSO4＜K2HPO4＜蛋白胨＜蔗糖。結(jié)論如下：蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)最佳pH為7；最佳裝液量為250 mL裝液100 mL；最佳溫度為22℃；最佳碳源為蔗糖；最佳氮源為蛋白胨。蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合濃度為蔗糖 30 g·L-1、蛋白胨 2.5 g·L-1、K2HPO41 g·L-1、MgSO40.1 g·L-1。