馬 龍 顏宏利

目前，隨著環(huán)境暴露的影響和生活方式的改變，不育癥已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的社會問題,困擾著10%～15%的夫婦，其中與男性因素有關(guān)的病例約占50%[1]。為了保護(hù)和保存男性生育能力，研究者們進(jìn)行了大量研究，但是目前對精原干細(xì)胞(spermatogonia stem cells，SSC)維持自我更新和分化的機制和雄配子形成的調(diào)控機制等問題還缺乏明確的認(rèn)知。利用單細(xì)胞測序可以解析包括SSC在內(nèi)的各種生精細(xì)胞及其微環(huán)境的中體細(xì)胞的特點，更精準(zhǔn)地從分子層面闡釋SSC自我更新和分化、精原細(xì)胞分化和配子形成的過程，為SSC的研究以及男性不育癥的診斷和治療提供新的方向。

一、單細(xì)胞測序技術(shù)概述

傳統(tǒng)的測序方法通常是從多個細(xì)胞中抽提DNA或RNA進(jìn)行測序，其結(jié)果往往只能代表細(xì)胞的平均水平或其中數(shù)量占優(yōu)勢的細(xì)胞的水平，忽略了單個細(xì)胞獨有的特性。單細(xì)胞測序技術(shù)是從單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀遺傳組變化的技術(shù)，從不同角度揭示細(xì)胞在不同階段的功能和特性，可以通過一次建庫，獲得幾千個單細(xì)胞的信息[2]。單細(xì)胞測序技術(shù)能夠解決罕見細(xì)胞的分析、人組織發(fā)育分化的特征研究、腫瘤的異質(zhì)性和微進(jìn)化研究等傳統(tǒng)測序方法難以解決的問題。

1．單細(xì)胞測序技術(shù)原理:單細(xì)胞測序技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用主要得益于微滴技術(shù)的發(fā)展[3]。在實驗中，每個細(xì)胞被封裝在一個納米級微滴中(圖1)，該微滴中含有帶條形碼的聚胸腺嘧啶脫氧核苷酸。一個細(xì)胞的所有DNA或RNA與一個唯一的條形碼相關(guān)聯(lián)，使得研究者可以跟蹤單個細(xì)胞信息，從而對合并的文庫進(jìn)行大規(guī)模的并列分析，可以在一次實驗中實現(xiàn)對數(shù)千個單細(xì)胞進(jìn)行分析[4]。另一種基于小孔的策略，則不需要捕獲微滴中的細(xì)胞。單個細(xì)胞被重力驅(qū)動進(jìn)入芯片的微套管，在微套管中，孔的大小只允許單個帶條形碼的珠子和單個細(xì)胞結(jié)合，從而實現(xiàn)單細(xì)胞的分離分析[5]。

單細(xì)胞測序技術(shù)實現(xiàn)的另一個重要技術(shù)突破是將唯一分子標(biāo)識符(unique molecule identifier，UMI)合并進(jìn)來，從而能夠更好地量化單細(xì)胞測序的讀取數(shù)。由于每個轉(zhuǎn)錄本都被唯一的UMI識別，因此這種方法可以區(qū)分反轉(zhuǎn)錄過程和cDNA擴增過程中合成的假陽性計數(shù)。其他重要的技術(shù)還有多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)。MALBAC利用特殊引物，使得擴增子的結(jié)尾互補而成環(huán)，從而很大程度上防止了DNA的指數(shù)性擴增，是目前應(yīng)用最廣的全基因組擴增技術(shù)。

2.單細(xì)胞測序技術(shù)流程：單細(xì)胞測序技術(shù)主要涉及4個主要步驟，包括單細(xì)胞分離、文庫構(gòu)建、基因測序和數(shù)據(jù)分析。以最常用的睪丸組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序為例，如圖1所示。(1)單細(xì)胞分離:睪丸組織通過機械和酶消化分離得到單細(xì)胞懸液，該單細(xì)胞懸液既可以直接進(jìn)行無偏倚的篩選分析，也可以先利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)或免疫磁珠(MACS)等技術(shù)進(jìn)行分選，再進(jìn)行分析。(2)文庫構(gòu)建：以10×Genomics平臺為例，其技術(shù)核心是油滴包裹的凝膠珠。該系統(tǒng)有75萬種唯一的帶條形碼的凝膠珠，每種珠子上有(40～80)萬個探針。油滴將含單個細(xì)胞的凝膠珠包裹起來，形成一個微滴，在微滴內(nèi)完成細(xì)胞裂解、RNA反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴增等連續(xù)步驟，最終生成文庫，其中來自單個細(xì)胞的所有cDNA共享一個條形碼。(3)基因測序：對構(gòu)建得到的帶條形碼的文庫進(jìn)行高通量測序。(4)數(shù)據(jù)分析：單細(xì)胞測序技術(shù)提供了大量的數(shù)據(jù)，必須利用復(fù)雜的計算工具來解釋這些數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)處理包括：①質(zhì)量控制和過濾，以消除低質(zhì)量序列、死細(xì)胞和多個細(xì)胞捕獲產(chǎn)生的干擾;基于微滴條碼分配的解碼;測序結(jié)果與參考數(shù)據(jù)庫的比對;②測序結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化和量化；③聚類分析，通過擬時序分析形成細(xì)胞發(fā)展軌跡。

圖1 睪丸組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序示意圖

二、單細(xì)胞測序技術(shù)在SSC研究中的應(yīng)用

1.揭示SSC的異質(zhì)性：很多研究在對單細(xì)胞測序結(jié)果進(jìn)行聚類和單細(xì)胞軌跡推斷后發(fā)現(xiàn)，人類SSC具有高度異質(zhì)性[6～10]。不同的研究將SSC到分化精原細(xì)胞分成了3種、4種或5種不同的細(xì)胞狀態(tài)。Wang等[7]對正常供者和非梗阻性無精子癥供者的睪丸進(jìn)行單細(xì)胞測序，將精原細(xì)胞分成了3個細(xì)胞群。2017年，Guo等[10]對SSEA4+SSC和c-KIT+分化精原細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組測序分析，確定了4個細(xì)胞群，并將其命名為“狀態(tài)1～4”。2018年，Guo等[9]對完整的睪丸細(xì)胞懸液進(jìn)行了無偏倚實驗，又確定了附加“狀態(tài)0”?！盃顟B(tài)0”被排除在先前的實驗之外，可能與其參與SSEA4表達(dá)的ST3GAL2基因的低轉(zhuǎn)錄有關(guān)?！盃顟B(tài)0”和“狀態(tài)1”可能代表兩種不同的靜止SSC狀態(tài)。Hermann等[6]對SSC使用擬時序分析時還發(fā)現(xiàn)，表達(dá)已知SSC標(biāo)志物的細(xì)胞位于發(fā)育軌跡的中間，提示SSC的同一性和異質(zhì)性可能比預(yù)期的更為復(fù)雜。

2.揭示SSC的分子特征：很多研究利用單細(xì)胞測序技術(shù)，對已有的SSC分子標(biāo)志物進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)了大量新的SSC分子標(biāo)志物，同時也發(fā)現(xiàn)了調(diào)控SSC自我更新和維持未分化狀態(tài)的機制。Hermann等[6]利用擬時序軌跡分析，在起點附近發(fā)現(xiàn)了典型的SSC基因：GFRA1、ID4、ETV5、NANOS2、PAX7、TSPAN8、RHOX10和ZBTB16，同時還發(fā)現(xiàn)了一組新的基因：DUSP6、EPHA2、PTPN13、PVR和TCL1。DUSP6是一種雙特異性磷酸酶，能調(diào)節(jié)有絲分裂原活化蛋白激酶活性，PTPN13是已知的一種磷酸酶，可抑制激酶級聯(lián)活性并影響細(xì)胞代謝和增殖狀態(tài),TCL1是絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT的共刺激因子。這提示細(xì)胞內(nèi)信號通路的調(diào)控可能在SSC功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其他表達(dá)量較大的基因和通路有：參與翻譯控制的基因(EIF4E、EIF4EBP1、PABPC1、RPTOR)和通路(EIF2、mTOR)，控制細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因(F2R、GNAQ、PLCE1、PPP1CB、SHC1)和通路(PLC、Thrombin)。同時，在擬時序軌跡的中點發(fā)現(xiàn)了翻譯控制基因(EIF4B、MLST8、PABPC1)和通路(EIF2、mTOR)、糖酵解基因(ALDOA、ENO3、PFKL、TPI1)和已知的SSC基因(ID4、NANOS2)。在SSC亞群中也能觀察到GDNF、FGF2和WNT信號通路的上調(diào)[7,10]。這些基因和信號通路在調(diào)控SSC的自我更新和維持未分化狀態(tài)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[11,12]。

3.揭示睪丸體細(xì)胞的分子特征：除了生精細(xì)胞系的特征，單細(xì)胞測序技術(shù)還探索了構(gòu)成睪丸組織的體細(xì)胞群之間的相互作用，包括在維持SSC自我更新、誘導(dǎo)SSC分化中發(fā)揮重要作用的龕位細(xì)胞。目前，對睪丸細(xì)胞的單細(xì)胞測序?qū)嶒炓呀?jīng)提供了大量關(guān)于小鼠、人類新生兒、人類嬰兒、有生育能力的成年男性和非阻塞性無精子癥男性的SSC龕位信息[8, 9]。Guo等[9]從成人睪丸種分離出了5類細(xì)胞：Sertoli細(xì)胞、肌樣細(xì)胞、Leydig細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,這與Green等[13]在成年小鼠睪丸中分離出的細(xì)胞一致。Guo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中，NOTCH通路受體NOTCH4和下游信號因子JAG1、HES1和MAML1被特異性上調(diào)。在成人肌樣細(xì)胞和Leydig細(xì)胞中，Hedgehog通路的受體PTCH1和PTCH2以及下游信號元件GLI和IGFBP6均有高表達(dá)。在Sertoli細(xì)胞中，整合素ITGA6高表達(dá)，這是一種主要存在于人類輸精管基膜中的蛋白。在Sertoli細(xì)胞還表達(dá)WFDC2和PRND，前者是一種已知的可以促進(jìn)精子成熟的附睪蛋白，后者編碼一種糖基磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白。PDGFB在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其受體PDGFRA和PDGFRB則存在于肌樣細(xì)胞和Leydig細(xì)胞中，這提示內(nèi)皮細(xì)胞可能通過與其他體細(xì)胞的串?dāng)_機制間接影響生精細(xì)胞的發(fā)育。

4.揭示精子形成的詳細(xì)過程：精子形成是一個復(fù)雜而又高度有序的過程。受標(biāo)本限制，對于人類男性生殖系統(tǒng)的研究很大程度上需要依賴動物模型。Wang等[7]和Green等[13]于2018年分別繪制了成年男性和雄性小鼠生殖細(xì)胞成熟過程的基因表達(dá)動態(tài)圖譜。他們的工作證實了小鼠和人類精子形成過程的相似性，確認(rèn)了小鼠作為研究與人類不育有關(guān)的同源基因的模型的可行性。Hermann等[6]也對小鼠和人類的生精細(xì)胞中的RNA進(jìn)行了平行分析，其研究結(jié)果支持小鼠和人類之間存在轉(zhuǎn)錄組同源性的觀點，并提出可以利用小鼠生精細(xì)胞的分子標(biāo)志物來鑒定人類生精細(xì)胞，為人類精子形成的探索提供支持。Law等[14]對E16.5、P0、P3和P6的小鼠睪丸進(jìn)行單細(xì)胞測序分析發(fā)現(xiàn)，小鼠SSC的發(fā)育軌跡早在胚胎期就已經(jīng)被提前設(shè)定。

目前已經(jīng)有很多單細(xì)胞測序研究對人類樣本進(jìn)行了分析，得到了從胎兒期的原始生殖細(xì)胞到成熟精子細(xì)胞的人類男性生殖譜系的關(guān)鍵信息[6～10,15～19]。Sohni等[8]研究發(fā)現(xiàn)新生兒睪丸中存在兩種生殖細(xì)胞，其中一種細(xì)胞的表達(dá)譜與胎兒期的原始生殖細(xì)胞的表達(dá)譜高度相似，另一種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式與成人SSC相似，被認(rèn)為是SSC前體細(xì)胞[16]。這表明，新生兒期的SSC前體細(xì)胞可能由胎兒期的原始生殖細(xì)胞發(fā)育而來。Guo等[9]也發(fā)現(xiàn)嬰兒(13個月)的生殖細(xì)胞和成人(17～24歲)的“狀態(tài)0”細(xì)胞的基因表達(dá)相似，并將嬰兒的生殖細(xì)胞定位在發(fā)育軌跡的起點,隨后是“狀態(tài)0”。這些嬰兒生殖細(xì)胞代表著從1歲到青春期一直存在的靜態(tài)儲備SSC池。在人類青春期階段的精子第1波形成中出現(xiàn)的生殖細(xì)胞類型與在成年階段精子持續(xù)穩(wěn)定形成中出現(xiàn)的生殖細(xì)胞類型不同，這個現(xiàn)象與出生后1周的小鼠模型中觀察到的現(xiàn)象一致[8，20]。為了描述這個過程,Guo等[19]分析了4個青春期男孩的睪丸細(xì)胞，得到了男性青春期第1波精子形成的關(guān)鍵信息。

結(jié)合已有的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和免疫組化研究，人類SSC從胎兒期至成年期可分為4個相對獨立的階段：①胎兒期到新生兒期，原始生殖細(xì)胞變?yōu)镾SC階段；②新生兒期到青春期前，SSC靜止或緩慢自我更新階段；③青春期早期，短暫的SSC增殖，有限且不完全的SSC分化階段；④成年期，SSC穩(wěn)定的自我更新和分化發(fā)育為完整的精子細(xì)胞階段。

三、單細(xì)胞測序技術(shù)在SSC研究中的局限性和改進(jìn)方向

單細(xì)胞測序技術(shù)在SSC研究中也有著局限性，現(xiàn)階段發(fā)展的單細(xì)胞測序技術(shù)存在耗時長、費用高、樣本要求高等問題，同時不同實驗的測序結(jié)果數(shù)據(jù)可能有很大差異。除了各種實驗標(biāo)本的生物學(xué)差異外，一個主要原因是不同實驗使用的單細(xì)胞測序的技術(shù)參數(shù)不同[21]。因此在設(shè)計和評價單細(xì)胞測序研究時，應(yīng)嚴(yán)格考慮以下因素：(1)生物學(xué)重復(fù)數(shù)：不同批次處理的樣品可能會產(chǎn)生差別，不同的細(xì)胞分離方法也可能影響其轉(zhuǎn)錄譜，因此，最好使用多個生物學(xué)重復(fù)，以增強數(shù)據(jù)的可靠性與穩(wěn)健性[22，23]。(2)最終分析的細(xì)胞數(shù)量以及是否預(yù)先分選：最終分析的細(xì)胞數(shù)量對于單細(xì)胞測序是一項關(guān)鍵參數(shù)，尤其對于檢測罕見細(xì)胞類型至關(guān)重要。罕見細(xì)胞的低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本很可能由于擴增的差異和基因缺失導(dǎo)致假陰性事件，因此對罕見細(xì)胞的研究可能需要預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞的分選。然而，預(yù)先使用抗體進(jìn)行分選又可能會使分析產(chǎn)生偏倚，因此設(shè)計實驗時應(yīng)當(dāng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇是否進(jìn)行預(yù)先分選。(3)其他技術(shù)參數(shù)：如測序深度也必須考慮。不同測序方法中的測序深度可能有很大的差異，Svensson等[24]研究表明，單細(xì)胞測序技術(shù)的敏感度比準(zhǔn)確性更依賴于測序深度。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序捕捉選定細(xì)胞特定時間點的基因表達(dá)譜，但這個表達(dá)譜是缺乏任何時間或空間的背景，而空間位置是又細(xì)胞功能和命運的決定因素。熒光原位雜交(FISH)靶向的方法可以用來彌補空間信息的缺失和補充單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集。利用互補的熒光標(biāo)記探針，RNA可以在其自然環(huán)境中定位。RNA熒光原位雜交技術(shù)通過使用針對單個mRNA分子的多種探針，實現(xiàn)了組織中少數(shù)基因的表達(dá)的量化和定位。后來又研發(fā)出連續(xù)FISH法，例如Lubeck等用的與目標(biāo)RNA的順序雜交的方法，增加了可檢測RNA的種類，并且實現(xiàn)了不同種類RNA的同時量化[25～28]。

四、展 望

2018年，美國《Science》雜志將單細(xì)胞基因活性分析技術(shù)列為年度頭號科學(xué)突破，自此引起了應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)的浪潮，不少研究者認(rèn)為，單細(xì)胞測序技術(shù)將會在未來10年內(nèi)改變基礎(chǔ)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的格局。

單細(xì)胞測序技術(shù)使得SSC研究有了突破性的進(jìn)展，通過對上萬個單細(xì)胞進(jìn)行高通量測序，不僅可揭示精原干細(xì)胞的異質(zhì)性，還可以提供精原干細(xì)胞及其微環(huán)境的分子特征，建立精子形成的動態(tài)圖譜。同時，單細(xì)胞測序技術(shù)也為男性不育癥的診療提供的新的方向：(1)可以輔助男性不育癥的診斷，實現(xiàn)男性不育癥更精細(xì)的分類，為后續(xù)的治療提供理論基礎(chǔ)。(2)可以評估可能導(dǎo)致精子生成受損的基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀遺傳組變化，實現(xiàn)對患者的分子靶向治療或細(xì)胞治療。(3)可以明確維持SSC體外增值的生長因子或細(xì)胞因子配方，實現(xiàn)SSC的體外培養(yǎng)，或者進(jìn)一步誘導(dǎo)分化得到成熟的精子細(xì)胞。