綦 惠，黃 霸，杰永生，鄭 蕊，舒 雄，陳 磊，劉丹平*

（1北京積水潭醫(yī)院北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京100035；2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院運(yùn)動與關(guān)節(jié)一科，遼寧錦州121000）

骨質(zhì)疏松（osteoporosis,OP）是一種全身性骨骼 疾病，它的特點(diǎn)為骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨量減少，骨強(qiáng)度下降和脆性增加［1，2］。我國65歲以上人群OP患病率達(dá)32.0%，是老年人致殘和致死的主要原因之一。盡可能恢復(fù)或維持OP患者的骨量，防范骨折的發(fā)生，是提高其生活質(zhì)量的重要舉措。臨床上治療OP的藥物大部分是骨吸收抑制劑，主要通過抑制骨吸收、延緩骨量丟失發(fā)揮作用，對已丟失的骨組織無作用。促進(jìn)骨生成的代表藥物甲狀旁腺素類似物，能夠增加骨密度，改善骨質(zhì)量，但常伴隨有惡心、頭痛和眩暈等副作用［2］。因此探尋新的治療方法，彌補(bǔ)當(dāng)前藥物治療的不足，對于OP的防治具有十分重要的意義。

具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchy?mal stem cells,MSCs）已被證實(shí)能夠促進(jìn)骨生成和血管再生［3，4］。近期的研究表明，MSCs的組織修復(fù)功能很大程度上依賴于其產(chǎn)生的外泌體［5，6］。外泌體（exosomes,Exos）是一種直徑在30～100 nm的脂質(zhì)雙分子層膜性囊泡，可由多種細(xì)胞分泌。外泌體內(nèi)包裹著蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等小分子物質(zhì)在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用［7-9］。既往的研究證實(shí)，MSCs源性外泌體能夠減輕骨軟骨損傷局部的炎性反應(yīng)，促進(jìn)軟骨修復(fù)［10］，而且還能夠促進(jìn)激素性股骨頭壞死部位的骨生成［11］。本研究通過體外獲取和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs）和BMSCs源性外泌體，以探索外泌體在骨質(zhì)疏松骨生成中的作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

12周齡SD雌性大鼠18只，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)基（Hy?Clone），胎牛血清（Invitrogen），胰蛋白酶、II型膠原酶（Gibco），CCK8、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、IBMS、抗壞血酸等（Sigma），CD63、CD81、CD9 一抗（Abcam），羊抗兔二抗（中衫金橋），BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒（碧云天），其他染色液均購自索萊寶。細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國），超凈操作臺（海爾，中國），離心機(jī)（Sigma，美國），酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國），熒光顯微鏡、病理切片機(jī)（Leica，德國），倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），Micro-CT機(jī)（Skyscan，比利時）。

1.2 外泌體的提取和鑒定

采用密度梯度離心法獲取BMSCs，應(yīng)用茜素紅、油紅O和甲苯胺藍(lán)染色檢測BMSCs的三向分化能力。無血清培養(yǎng)基將BMSCs培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)液，2 000 g離心15 min，取上清，100 000 g離心兩次，每次70 min，棄上清，獲取的沉淀是BMSCs源性外泌體（exosomes derived from bone marrow mes?enchymal stem cells,BMSC-Exos）。采用無菌PBS重懸BMSC-Exos。透射電鏡觀察BMSC-Exos的形態(tài)特征，Western blot對BMSC-Exos表面蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3 體外實(shí)驗(yàn)

BMSC-Exos對BMSCs增殖的影響：BMSCs接種于96孔板，每孔200 μl。對照組采用正常培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入BMSC-Exos，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束時，將含10%CCK8的培養(yǎng)基以換液的形式加入，反應(yīng)2 h。酶標(biāo)儀上檢測OD450。

BMSC-Exos對BMSCs成骨轉(zhuǎn)化的影響（堿性磷酸酶活性檢測）：細(xì)胞分為兩組，對照組采用成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組在成骨誘導(dǎo)液中加入BMSCExos，均誘導(dǎo)7 d。將不同組細(xì)胞分別與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體孵育后，洗滌3～5次。依據(jù)BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒提供的說明書，配置BCIP/NBT染色工作液。加入適量BCIP/NBT染色工作液，避光孵育，顯微鏡下控制孵育時間。蒸餾水洗滌1～2次，終止顯色。

1.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

OP大鼠模型的建立：SPF級12周齡雌性SD大鼠，體重（220.67±10.58）g，隨機(jī)分為對照組、卵巢切除（ovariectomy,OVX）組、OVX+Exos組。

進(jìn)行水合氯醛麻醉，俯臥位固定，對照組動物僅切開背部皮膚后縫合，后兩組動物切除雙側(cè)卵巢，手術(shù)線結(jié)扎輸卵管及周圍相連血管。并分別在術(shù)后由尾靜脈注射等體積的PBS和BMSC-Exos。

HE染色：取股骨多聚甲醛固定24 h，10%EDTA脫鈣，梯度酒精脫水、清洗和包埋后，切成5 μm切片，置于載玻片上。進(jìn)行常規(guī)HE染色。觀察骨小梁的情況。

Micro-CT：取股骨，置于多聚甲醛中固定，利用Micro-CT進(jìn)行掃描，圖像分析軟件對掃描后的圖像進(jìn)行三維重建，對骨密度（bone mineral density,BMD）進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。均數(shù)間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的提取和鑒定

最初分離的BMSCs主要呈單個細(xì)胞分布，圓形。傳代后，細(xì)胞生長迅速，呈梭形或紡錘形（圖1a）。成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色與鈣發(fā)生反應(yīng)，觀察到多個被染成深紅色的鈣結(jié)節(jié)（圖1b）；成脂誘導(dǎo)后，油紅O染色觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)亮紅色脂滴（圖1c）；成軟骨誘導(dǎo)后，甲苯胺藍(lán)染色觀察到胞漿呈藍(lán)染（圖1d）。

圖1 BMSCs的形態(tài)和三向分化鑒定 1a:貼壁的BMSCs呈梭形（倒置鏡下，（×40） 1b:茜素紅染色鑒定BMSCs的成骨分化（×40） 1c:油紅O染色鑒定BMSCs的成脂分化（×40） 1d:甲苯胺藍(lán)染色鑒定BMSCs的成骨分化（×40）

透射電鏡下，可見外泌體呈囊泡狀，近似球形，大小不完全一致，直徑在30～150 nm（圖2a）。West?ern blot檢測外泌體的表面蛋白，顯示外泌體表達(dá)CD63，CD81和 CD9（圖 2b）。

圖2 BMSC-Exos的鑒定 2a:透射電鏡下觀察BMSCExos呈近似球形 2b:Western-blot分析BMSC-Exos表面表達(dá)CD63、CD81和CD9

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSC-Exos促進(jìn)BMSCs增殖和提高堿性磷酸酶活性。CCK8檢測表明，與對照組相比，BMSC-Exos與BMSCs共培養(yǎng)24 h，細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)（P=0.028）；培養(yǎng)48 h，增殖更為明顯（圖3a）。堿性磷酸酶活性檢測顯示，成骨誘導(dǎo)7 d后，與對照組相比，BMSC-Exos組堿性磷酸酶染色明顯增強(qiáng)（圖3b）。

圖3 BMSC-Exos對BMSCs增殖和堿性磷酸酶活性的影響 3a:CCK8檢測BMSC-Exos對BMSCs增殖影響的直方圖，*表示與對照組相比，P＜0.05 3b,3c:堿性磷酸酶染色（×40），可見BMSC-Exos組（3c）的著色顯著深于對照組（3b）

2.3 體內(nèi)試驗(yàn)

HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，OVX組骨小梁稀疏，變細(xì)，間隙增大，給予BMSC-Exos注射之后，骨小梁明顯增多（圖4a）。股骨下段橫斷面的Micro-CT結(jié)果顯示，對照組骨小梁數(shù)量多，直徑粗，排列致密且相對規(guī)則；OVX組骨小梁數(shù)量明顯減少和變細(xì)，相互之間間距增大；OVX+Exos組骨小梁數(shù)量介于前兩組之間，但直徑仍然較細(xì)，間距改善不明顯（圖4b）。應(yīng)用Micro-CT對股骨標(biāo)本進(jìn)行三維重建后，檢測相對骨密度BMD，結(jié)果顯示OVX組BMD顯著降低（P=0.021），與OVX組相比，OVX+Exos組BMD顯著升高（P=0.034），但仍低于對照組（P=0.019）（圖 4c）。

圖4 BMSC-Exos對卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松的作用 4a:HE染色結(jié)果（40×） 4b:Micro-CT掃描圖像結(jié)果 4c:骨密度（BMD）檢測結(jié)果。*與對照組相比P＜0.05；與OVX組相比，OVX+Exos組BMD顯示升高，#與OVX組相比P＜0.05

3 討論

隨著老齡化社會的到來和人均壽命不斷增加，骨質(zhì)疏松（osteoporosis,OP）的發(fā)病率也呈上升趨勢。OP是受到多種因素影響的全身性疾?。?，2］。正常骨組織微生態(tài)環(huán)境下，骨生成和骨吸收之間處于動態(tài)平衡；OP微生態(tài)環(huán)境下，動態(tài)平衡發(fā)生變化，骨吸收強(qiáng)于骨生成，從而導(dǎo)致骨量降低，骨脆性增加，發(fā)生骨折的風(fēng)險增加［1，2］。因此，增強(qiáng)骨生成能力將能從根本上改善OP的骨組織狀態(tài)，降低骨折發(fā)生率。

外泌體是細(xì)胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過程生成和分泌的脂質(zhì)雙分子層膜性囊泡［12］。外泌體帶有其來源細(xì)胞的特征，且包裹著多種生物活性物質(zhì)，外泌體不僅可以保護(hù)這些生物活性物質(zhì)在細(xì)胞外環(huán)境中不被降解和稀釋，也可以促進(jìn)這些物質(zhì)通過組織液或血液等遠(yuǎn)距離運(yùn)輸［7-9］。因此，外泌體在調(diào)節(jié)微環(huán)境、調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為和組織修復(fù)中均發(fā)揮重要作用。已有的研究證實(shí)，MSCs來源的外泌體參與成骨、破骨、成血管以及炎癥反應(yīng)等骨代謝的生物學(xué)過程［13-16］。在正常環(huán)境下，MSCs源性外泌體促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移；炎性環(huán)境下，外泌體仍能夠?qū)寡仔砸蜃訉?dǎo)致的軟骨細(xì)胞增殖減弱的情況，使軟骨細(xì)胞保持一定增殖活力［17］。

本研究首先分析了外泌體對MSCs增殖的作用，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠顯著促進(jìn)MSCs的增殖。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予外泌體之后，堿性磷酸酶活性上調(diào)，證實(shí)MSCs的成骨分化增強(qiáng)。Liu等［18］研究也發(fā)現(xiàn)，正常骨髓MSCs分泌的外泌體可靶向調(diào)控MRL-lpr狼瘡小鼠骨髓MSCs的功能與活性，促進(jìn)成骨分化［18］。由于OP大鼠的MSCs數(shù)量少，獲取和體外培養(yǎng)均較為困難，本研究中采用的MSCs是正常MSCs，后續(xù)將進(jìn)行OP大鼠MSCs的培養(yǎng)，分析正常MSCs源性外泌體對OP大鼠MSCs的生物學(xué)行為的影響，將更具有說服力。另有研究證實(shí)，MSCs源性外泌體可被成骨細(xì)胞攝取，有助于增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖，縮短骨愈合時間［16］。因此，MSCs源性外泌體可能通過作用于多種細(xì)胞，發(fā)揮對骨生成的促進(jìn)作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除動物模型，是目前較為公認(rèn)的OP動物模型。大鼠去卵巢后，雌激素水平下降，骨生成和骨吸收之間的平衡被打破，導(dǎo)致骨丟失增加。HE染色顯示，OVX組骨小梁結(jié)構(gòu)變細(xì)，排列紊亂，骨小梁數(shù)量減少，間距增大。Micro-CT也證實(shí)了BMD下降，骨小梁數(shù)量和厚度顯著降低，而骨小梁空隙加大，表明OP模型成功建立。當(dāng)尾靜脈注射外泌體之后，HE染色表明，與OVX組相比，骨小梁變粗，排列也略有恢復(fù)。Micro-CT結(jié)果顯示，與OVX組相比，BMD有所提高，骨小梁數(shù)量增多，厚度增加，骨小梁空隙減小，但是與對照組相比，BMD仍然未達(dá)到正常狀態(tài)，骨小梁數(shù)量和厚度也較正常組有顯著降低，骨小梁空隙仍較大。表明MSCs源性外泌體可以有效促進(jìn)OP的骨生成，改善骨小梁結(jié)構(gòu)和數(shù)量，盡管仍然無法達(dá)到正常骨結(jié)構(gòu)，但對于延緩OP進(jìn)展和降低OP骨折將具有很好的應(yīng)用前景。之所以無法達(dá)到正常骨結(jié)構(gòu)，一方面可能與外泌體用量以及治療時間的長短有關(guān)；另一方面，體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境單一，外泌體發(fā)揮作用的方式較為直接，在體環(huán)境受到多方面的影響，外泌體靜脈注射后，真正發(fā)揮作用的濃度達(dá)不到其在體外的有效濃度，因此，后續(xù)研究將加大在體實(shí)驗(yàn)的用量，并相應(yīng)延長治療時間，進(jìn)一步分析其對OP的治療作用和相關(guān)機(jī)制。

本研究證實(shí)，MSCs源性外泌體能夠促進(jìn)MSCs增殖和成骨轉(zhuǎn)化，并且能夠改善OP動物模型的骨結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨生成。由于外泌體中包裹著多種生物活性物質(zhì)，外泌體可以作為載體將這些活性物質(zhì)傳遞到目標(biāo)細(xì)胞中，因此如果將成骨關(guān)鍵物質(zhì)轉(zhuǎn)移到外泌體內(nèi)，則有可能更好的促進(jìn)骨生成。因此，外泌體在OP的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。