梁璇，張正，單妍，謝薇，顧龍龍

(昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部生物化學(xué)暨分子生物學(xué)教研室,昆明 650106)

長期高糖、高脂飲食并攝入大量酒精會對肝臟產(chǎn)生不可逆的損傷[1]。黃亞等[2]研究表明：人腸道微生物種類超過1 000種，總數(shù)量超過1014，是人體細(xì)胞的10 倍。人的腸道菌群主要分為三類：益生菌(probiotics)、致病菌(pathogenic bacterium)、無害菌(harmless bacteria)。益生菌制劑是一種可以平衡腸道菌群生態(tài)，對宿主健康有益的活體微生物制劑。本文旨在研究腸道益生菌補(bǔ)充對酒精、高糖、高脂致肝損傷大鼠肝功能和腸道菌群的影響，以期了解腸道益生菌補(bǔ)充對酒精、高糖、高脂致肝損傷大鼠肝功能和腸道菌群保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級3周齡大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號:SCXK(京)2017-0022，普通級，分4個籠子飼養(yǎng)，每個籠子10只。飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室。

1.2 藥物與試劑 益生菌(主要包含：嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌及乳雙歧桿菌，其含量為1×1011CFU/L)購自日本國養(yǎng)樂多株式會社；DAO、D-LA ELISA 檢測試劑盒購自上海迪奧生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α) 、白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；NF-κB抗體購自上海滬震實業(yè)有限公司；紅星牌二鍋頭白酒北京釀酒總廠出品，酒精度55%；乙醇檢測試劑盒購自北京智微科技有限公司。菌群檢測所用藥物及試劑。

1.3 儀器 低溫高速離心(德國Eppendorf公司產(chǎn))，恒溫水浴箱(天津泰新特儀器公司產(chǎn))，光學(xué)顯微鏡(美國Thermo公司產(chǎn))，熒光分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn))，全自動生化分析儀(日本日立公司產(chǎn))，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司產(chǎn))。全自動生化儀，以及WB所用儀器。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 40 只大鼠隨機(jī)分為 4組，即空白對照組、模型組、低劑量腸道益生菌組和高劑量腸道益生菌組。空白照組喂普通飼料，其余各組以高糖高脂飼料[3](68%基礎(chǔ)飼料、10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1%膽固醇、1%膽鹽) 喂養(yǎng)，并每天使用紅星二鍋頭灌胃，灌胃濃度為：5 mL/kg，濃度每周遞增1 mL/kg，于第7周末造成大鼠 AFLD 模型。

1.4.2 分組及藥物干預(yù) 40 只大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照組、模型組、低劑量腸道益生菌組(簡稱低劑量組)和高劑量腸道益生菌組(簡稱高劑量組)。建立酒精、高糖、高脂致肝損傷大鼠模型后，低劑量腸道益生菌組使用益生菌灌胃劑量為：20×108CFU /kg，高劑量腸道益生菌組使用益生菌灌胃劑量為：40×108CFU /kg，模型組和空白對照組使用等量的0.9%氯化鈉注射溶液灌胃處理，每天灌胃1次，連續(xù)給藥28 d。

1.4.3 檢測項目

1.4.3.1 血清乙醇體積分?jǐn)?shù)測定 干預(yù)第45天時，將各組大鼠用55%乙醇灌胃后分別在 0.5 h、1 h、2 h、3 h進(jìn)行尾靜脈采血，每次采血量約為0.5 mL，使用低溫離心機(jī)在3 000 r/min、4 ℃條件下10 min得血清，按照EnzyChromTM乙醇檢測試劑盒說明書進(jìn)行血清乙醇體積分?jǐn)?shù)測定。

1.4.3.2 臟體比測量 干預(yù)7周后經(jīng)股動脈采血后頸椎脫臼處死全部大鼠，離心得血清，迅速留取大鼠肝臟，并測量大鼠肝臟和完整盲腸并稱質(zhì)量，分別計算大鼠的肝體比和盲體比。

1.4.3.3 血清生化指標(biāo)測定 使用全自動生化儀檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST) 、堿性磷酸酶(AKP) 、三酰甘油(TG) 、總膽固醇(TC) 、低密度脂蛋白固醇(LDL-C) 、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 水平。

1.4.3.4 使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測肝組織相關(guān)因子含量及酶含量 按照TNF-α、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、DAO、D-LA試劑盒說明書操作。

1.4.3.5 大鼠腸道菌群培養(yǎng) 實時熒光定量 PCR 方法對大鼠糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌及糞腸球菌 16Sr DNA V3 可變區(qū)進(jìn)行定量分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將提取的大鼠糞便基因組DNA 進(jìn)行以上 4 種菌株 16Sr DNA V3 可變區(qū)熒光定量 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備相同，由系統(tǒng)軟件 Eppendorf Mastercycler ep realplex 自動分析。PCR 擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)Ct值，將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出大鼠糞便樣品中菌群的含量。

1.4.3.6 使用Westen Bolt檢測NF-κB蛋白表達(dá)情況 以β-actin為內(nèi)參，使用GIS數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)分析得出PCR產(chǎn)物的吸光度值，以NF-κB吸光度值對比，以β-actin的吸光度值表示蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，用方差分析組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，進(jìn)一步采用SNK方法進(jìn)行比較；用單因素方差分析(ANOVA)時，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 血清乙醇體積分?jǐn)?shù)測定 由圖1可見，使用酒精灌胃后，相比空白對照組，模型組、低劑量腸道益生菌組和高劑量腸道益生菌組大鼠體內(nèi)乙醇含量1 h有一定程度的升高(P<0.05)，2～3 h時模型組大鼠體內(nèi)乙醇含量顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，高劑量腸道益生菌組顯著高于低劑量腸道益生菌組。

圖1 大鼠血清乙醇體積分?jǐn)?shù)觀察

2.2 大鼠臟體比測量 由圖2可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠肝臟臟體比顯著下降，盲體比顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比模型組，低劑量組和高劑量組肝臟臟體比顯著升高，盲體比顯著降低(P<0.05)，高劑量組肝臟臟體比顯著升高，盲體比顯著降低(P<0.05)。

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.01;與低劑量組比較，dP<0.05

2.3 血清中相關(guān)酶指標(biāo) 由表1可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內(nèi)ALT、AST、AKP含量顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組大鼠體內(nèi)ALT、AST、AKP含量有一定程度升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)ALT、AST、AKP含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠體內(nèi)ALT、AST、AKP含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清中相關(guān)酶含量情況

2.4 血脂情況 由表2可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內(nèi)TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)TG、TC、LDL-C、HDL-C含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)TG、TC、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，相比低劑量組，高劑量組大鼠體內(nèi)TG、TC、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)

2.5 肝組織相關(guān)因子含量 由圖3可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、TGF-β1含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注:與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

由表3可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內(nèi)DAO、D-LA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)DAO、D-LA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內(nèi)DAO、D-LA含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠體內(nèi)DAO、D-LA含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠DAO和D-LA含量檢測

2.6 大鼠糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量測量 由圖4 可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠糞便內(nèi)雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著升高，乳酸桿菌含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠糞便內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠糞便內(nèi)乳酸桿菌含量顯著升高，雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠糞便內(nèi)乳酸桿菌含量顯著升高，雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

2.7 大鼠肝組織NF-κB蛋白表達(dá)情況 由圖5 可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠NF-κB表達(dá)量顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠NF-κB表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠NF-κB表達(dá)量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠NF-κB表達(dá)量顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

3 討論

人體腸道中的正常微生物群在腸道不同節(jié)段與部位分布不盡相同，其主要生理作用是：生物屏障、免疫屏障等。人體攝入酒精由小腸吸收再由肝臟代謝，長期過大量飲酒會使腸道微生物群的種類和數(shù)目發(fā)生變化，某些菌群過度繁殖會造成腸道黏膜屏障的完整性破壞，促使內(nèi)毒素、氨等腸源性毒物滲漏入血液，血液流進(jìn)肝臟后，加重酒精性脂肪肝損傷[4]。因此，維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定，對防治酒精性肝損傷具有重要意義。研究表明：攝入活性益生菌制劑，可以改善腸道菌群失調(diào)，常見的腸道益生菌有：雙歧桿菌[5](bifidobacterium) 、乳酸桿菌[6](lactobacillus) 、嗜熱鏈球菌[7](streptococcus thermophilus)等。本實驗中模型大鼠補(bǔ)充腸道益生菌后，大鼠糞便內(nèi)乳酸桿菌含量顯著升高，雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著降低說明模型大鼠通過服用益生菌，腸道的益生菌群的種類和數(shù)量得到改善。

益生菌攝入對酒精導(dǎo)致的肝組織損傷具有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與益生菌發(fā)酵產(chǎn)物有關(guān)[8]。其中D-LA 是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物之一，可以有效地調(diào)節(jié)腸道的pH值，達(dá)到保護(hù)腸黏膜的作用。王昕等[9]研究表明：DAO是哺乳動物腸黏膜上層絨毛細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)酶，這種酶和D-LA在腸黏膜細(xì)胞遭到破壞時進(jìn)入血液，從而使得血液中兩種酶的含量成為腸道屏障功能檢測的重要指標(biāo)。本研究可以看出，使用益生菌灌胃的大鼠血清內(nèi)D-LA、DAO含量顯著減少，說明益生菌可以有效地緩解腸道黏膜的損傷，防止D-LA、DAO進(jìn)入血液，減輕了肝臟的負(fù)擔(dān)，有效地緩解了脂肪肝的進(jìn)展。這和姚芳芳等[10]研究得出的結(jié)論：益生菌可以通過保護(hù)腸黏膜達(dá)到緩解酒精性脂肪肝相一致。

蔡元麗等[11]實驗表明，肝臟脂肪含量增多，使得血液內(nèi)炎性因子IL-6及部分血清生化指標(biāo)發(fā)生異常變化。本研究中可以看出，模型組大鼠體內(nèi)的炎性因子IL-6顯著升高，使用益生菌灌胃后炎性因子含量顯著降低，說明益生菌可以有效緩解腸道內(nèi)黏膜的通透性，阻止炎性因子進(jìn)入血液，并有效緩解肝臟負(fù)擔(dān)。使用益生菌的大鼠血清內(nèi)TG、TC、LDL-C均顯著降低，說明大鼠脂肪肝得到了有效的緩解。這和唐彬等[12]研究得出的結(jié)論：益生菌可以通過降低體內(nèi)的炎性因子和血清LDL-C含量達(dá)到緩解脂肪肝的進(jìn)展相一致。

NF-κB是多種炎癥介質(zhì)的上游信號分子，可促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[13]。NF-κB可以調(diào)控多種急性反應(yīng)蛋白和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄過程，并參與肝臟炎癥的發(fā)生。劉鑫等[14]研究表明：TNF-α是肝損傷的重要因子之一，可直接或間接引起肝細(xì)胞的免疫損傷。本研究中，模型組大鼠體內(nèi)NF-κB表達(dá)顯著升高，說明大鼠肝臟受損較嚴(yán)重，使用益生菌灌胃處理后，大鼠體內(nèi)NF-κB表達(dá)顯著降低，且相關(guān)炎性因子的含量也顯著降低，說明益生菌可以有效抑制NF-κB的表達(dá)并降低體內(nèi)炎性因子的表達(dá)，從而達(dá)到緩解酒精性脂肪肝的發(fā)展。這和梁志清等[15]研究結(jié)論：益生菌可以通過抑制NF-κB的表達(dá)達(dá)到緩解酒精性脂肪肝的效果一致。

綜上所述，腸道益生菌補(bǔ)充對酒精性高糖高脂致肝損傷起到保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道益生菌的種類和數(shù)目、降低NF-κB蛋白的表達(dá)同時降低血清內(nèi)的炎性因子有關(guān)。