李嵐，鄭研，高瑛，張維華，侯麗敏，高秋英

(陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，西安 710068)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種惡性漿細(xì)胞病，約占所有血液腫瘤的10%。70%的MM患者出現(xiàn)嚴(yán)重骨痛，伴有溶骨性骨損傷，這是由于破骨細(xì)胞骨吸收增加和成骨細(xì)胞骨形成減少所致[1-2]。其特點(diǎn)是骨髓漿細(xì)胞惡性增殖，導(dǎo)致造血功能不全和骨溶解性骨病。此外，單克隆免疫球蛋白的過(guò)度產(chǎn)生可能導(dǎo)致有害的組織沉積，導(dǎo)致腎衰竭或淀粉樣變，從而影響心臟或腎臟等關(guān)鍵器官[3-4]。miRNAs是一種短鏈內(nèi)源性非編碼、高度保守的RNA，通過(guò)與3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)mRNA結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)。根據(jù)以往的研究，miRNAs參與了許多細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等[5]。許多研究已經(jīng)證明miRNAs的異常表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中起著重要的作用，在癌癥發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。大量研究表明miR-192-5p在惡性腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-192-5p的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)不同的機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生[6-9]。在人骨髓瘤中，miR-192-5p抑制骨髓瘤的發(fā)生。然而，miR-192-5p調(diào)節(jié)骨髓瘤發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討miR-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)水平及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，對(duì)照標(biāo)本為正常志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，已取得知情同意。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Trizol試劑、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳2～3代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-192-5p的表達(dá) 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物由廣州銳博生物技術(shù)公司合成，miR-192-5p引物序列為miR-192-5p-F：5'-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3'，miR-192-5p-R：5'-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3';U6引物序列為U6-F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6-R：5'-CGCTTCACGAATTTGCG -3'。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸25 s，循環(huán)40次。U6為 miR-192-5p的內(nèi)參，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值，以2-ΔΔCt計(jì)算miR-192-5P的相對(duì)表達(dá)量,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組 Ct-對(duì)照組Ct。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U266細(xì)胞以1×105/孔密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合度為70%左右時(shí)開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組，分別為miR-192-5p mimics組、mimics control 組、miR-192-5p inhibitor組、inhibitor control組。轉(zhuǎn)染后6 h換10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 利用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況，以5 000/孔的細(xì)胞密度接種于 96 孔板中，每組準(zhǔn)備3個(gè)96孔板，在24、48、72 h 時(shí)分別取一個(gè)96孔板，每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度值(OD值)。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在恒溫孵箱中培養(yǎng)，等細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)視野時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24 h，用marker筆在6孔板背后，用直尺比著劃?rùn)M線(xiàn)。使用無(wú)菌的10 μL移液器槍頭盡量垂直于背后的橫線(xiàn)劃痕，保證槍頭劃痕時(shí)垂直。劃好后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)0、24、48、72 h拍照記錄。

1.7 Transwell體外侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞撤血清饑餓培養(yǎng)12～24 h，進(jìn)一步去除血清的影響。胰蛋白酶消化細(xì)胞后離心，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗1～2遍，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，將Matrigel預(yù)涂到8 μm Transwell中。取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室上室，500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。用無(wú)菌棉簽輕度擦拭除去濾膜上的Matrigel基質(zhì)膠和細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min、結(jié)晶紫染色 1 min，PBS 清洗 5 min，在顯微鏡下觀察小孔膜表面的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，收集各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U266細(xì)胞，將細(xì)胞低速離心(1 500 r/min)5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入結(jié)合緩沖液制成細(xì)胞懸液；按試劑盒說(shuō)明書(shū)中建議的試劑體系用量依次加入5 μL Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI,10 mg/L)后輕輕混勻，在室溫下避光孵育15 min，設(shè)置調(diào)整流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.9 靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 應(yīng)用四個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan (http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirbase.org/)、microRNA(http://www.microrna.org/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)預(yù)測(cè) miR-192-5p的候選靶基因，結(jié)合既往研究結(jié)果，選擇USP1作為候選靶基因。

將野生型和突變型USP1 3′-UTRs序列插入到pmirGLO載體(美國(guó)Promega公司)中，Lipofectamine 2000試劑盒測(cè)定熒光素酶值。構(gòu)建含有 USP1基因 3′-非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)潛在結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒，包括野生型USP1基因 3′-UTR(WT-USP1 3′-UTR)和突變型 USP1基因 3′-UTR(MUT-USP1 3′-UTR)，放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；將?gòu)建好的 WT-USP1和 MUT-USP1分別與miR-192-5p mimics 或mimics control共轉(zhuǎn)染入中，實(shí)驗(yàn)分為4組：miR-192-5p mimics+ USP1+WT，miR-192-5p mimics+ USP1+MUT，mimics control + USP1+WT，mimics control + USP1+MUT。轉(zhuǎn)染48 h后，PBS 溶液洗滌 3 次，按雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。

1.10 Western-blot檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解緩沖液，離心后提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用10% SDS-PAGE上樣緩沖液電泳分離所有蛋白，并將其電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下?lián)u床封閉1 h，然后在4 ℃下與一抗USP1和GAPDH孵育過(guò)夜。用TBST清洗5次后，在室溫下用二抗孵育1 h。然后再次用TBST清洗膜3次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Western blot技術(shù)常規(guī)方法操作來(lái)檢測(cè)各組USP1蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-192-5p在骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)MM細(xì)胞株U266和正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-192-5p的表達(dá)水平相比，miR-192-5p在MM細(xì)胞株U266中的表達(dá)量(0.41±0.03)顯著低于對(duì)照組(0.98±0.05),t=16.932，P<0.01。

2.2 miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞增殖能力的影響 通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics組24 h(0.45±0.05)、48 h(1.01±0.09)、72 h(1.55±0.16)后U266細(xì)胞增殖活力顯著低于對(duì)照組24 h(0.89±0.09)、48 h(1.70±0.16)、72 h(2.64±0.29);t=7.402，P<0.01；t=6.510，P<0.01；t=5.700，P<0.01；轉(zhuǎn)染miR-192-5p inhibitor組24 h(0.92±0.08)、48 h(1.89±0.21)、72 h(2.85±0.27)后U266細(xì)胞增殖活均顯著高于對(duì)照組24 h(0.64±0.07)、48 h(1.15±0.13)、72 h(1.84±0.20);t=4.562，P<0.05；t=5.190，P<0.01；t=5.206，P<0.01。

2.3 miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞遷移能力的影響 通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探討miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics組U266細(xì)胞的遷移率(23.11±3.55)顯著低于對(duì)照組(59.63±6.61),t=8.431，P<0.01；轉(zhuǎn)染miR-192-5p inhibitor組U266細(xì)胞的遷移率(45.39±4.88)顯著高于對(duì)照組(31.02±3.52),t=4.137，P<0.05。

2.4 miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞侵襲能力的影響 通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探討miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics組U266細(xì)胞的侵襲數(shù)(125.13±17.63)顯著低于對(duì)照組(330.34±37.55),t=8.568，P<0.01；轉(zhuǎn)染miR-192-5p inhibitor組U266細(xì)胞的侵襲數(shù)(370.51±30.44)顯著高于對(duì)照組(290.67±18.97),t=3.856，P<0.05。

2.5 miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞凋亡能力的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-192-5p組細(xì)胞凋亡率(27.18±3.21)高于對(duì)照組(12.96±1.18),t=7.202，P<0.001;抑制miR-192-5p組細(xì)胞凋亡率(14.53±1.67)低于對(duì)照組(19.26±2.07),t=3.080，P<0.05。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-192-5p表達(dá)對(duì)MM細(xì)胞U266凋亡能力的影響(n=3)

2.6 miR-192-5p靶向基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 利用miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan，miRBase，microRNA，miRDB)進(jìn)行了miR-192-5p的靶基因預(yù)測(cè)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)，miR-192-5p可以與USP1基因3′-UTR區(qū)結(jié)合，特異性靶向作用于USP1基因(見(jiàn)圖2)。

圖2 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miR-192-5p與USP1 3′-utr區(qū)結(jié)合位點(diǎn)

通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在MM細(xì)胞U266中，miR-192-5p mimics+USP1+MUT組相對(duì)熒光素酶活性(1.20±0.09)與mimics control+USP1+MUT組(1.27±0.08)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.007，P>0.05)；miR-192-5p mimics+USP1+WT組熒光素酶活性(0.47±0.04)顯著低于mimics control+USP1+WT組(1.25±0.12),t=10.681，P<0.001。miR-192-5p抑制了USP1-3'UTR-WT相對(duì)素酶活性，在突變USP1的3'-UTR區(qū)，miR-192-5p失去了對(duì)USP1基因的抑制作用。

2.7 miR-192-5p調(diào)控USP1的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-192-5pmimics的USP1蛋白表達(dá)水平(0.46±0.04)顯著低于對(duì)照組(1.10±0.09),t=8.764，P<0.001，轉(zhuǎn)染miR-192-5p inhibitor的USP1蛋白表達(dá)水平(1.40±0.11)顯著高于對(duì)照組(0.89±0.06),t=7.050，P<0.01，表明了miR-192-5p對(duì)USP1的負(fù)向調(diào)控作用。見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-192-5p對(duì)U266細(xì)胞中對(duì)USP1蛋白的表達(dá)水平影響(n=3)

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種以骨髓中分泌抗體的生發(fā)中心血漿細(xì)胞浸潤(rùn)和克隆增殖為特征的腫瘤性疾病。它是第二常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有血液學(xué)惡性腫瘤的10%，多發(fā)于老年人。多發(fā)性骨髓瘤的臨床表現(xiàn)多種多樣，其典型表現(xiàn)為骨痛、反復(fù)感染、貧血、腎功能損害。由于骨髓異常漿細(xì)胞和單克隆免疫球蛋白過(guò)度增生，導(dǎo)致嚴(yán)重的體液免疫缺陷和骨損害，死亡率高，目前它的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[10-13]。miR-192-5p作為重要的調(diào)控因子參與基因的表達(dá)及細(xì)胞的生理活動(dòng)，miR-192-5p的異常表達(dá)在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[14]。以往研究表明，miR-192-5p在許多癌癥中均被顯著下調(diào)，而且miR-192-5p還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括增殖、遷移、侵襲和凋亡等等。如Feng等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-192-5p在肺癌中明顯偏低，通過(guò)RB1抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Lian等[16]證明，miR-192-5p通過(guò)靶向肝細(xì)胞癌的SLC39A6/SNAIL途徑減少了腫瘤轉(zhuǎn)移。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，miR-192在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)，且miR-192可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。近年來(lái)，許多研究表明USP1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)USP1可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為。Liu等[18]證實(shí)USP1在骨肉瘤中上調(diào)，沉默USP1可以通過(guò)減少一些下游蛋白(包括Notch信號(hào)傳導(dǎo))的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖和侵襲。Williams等[19]指出，USP1在骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制成骨細(xì)胞分化以及穩(wěn)定ID蛋白。Lee等[20]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常腦組織，USP1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，通過(guò)RNA干擾或用化學(xué)USP1抑制劑處理會(huì)減弱膠質(zhì)母瘤干樣細(xì)胞的克隆形成生長(zhǎng)和存活，并增強(qiáng)膠質(zhì)母瘤細(xì)胞的放射敏感性。本研究分析miR-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)水平以及調(diào)控機(jī)制，以期對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者的精準(zhǔn)治療提供更多的理論依據(jù)。

本研究選取了骨髓瘤細(xì)胞株U266作為研究對(duì)象。研究結(jié)果表明，與正常骨髓細(xì)胞相比，miR-192-5p在骨髓瘤細(xì)胞株U266中的表達(dá)水平顯著降低。進(jìn)一步研究miR-192-5p對(duì)MM細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。結(jié)果顯示miR-192-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MM細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用，對(duì)MM細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。而miR-192-5p低表達(dá)則具有相反作用。由此，本組推測(cè)miR-192-5p在MM細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌基因的功能。通過(guò)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)靶向預(yù)測(cè)，得出USP1可能是miR-192-5p在MM細(xì)胞中的潛在靶基因，進(jìn)而通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-192-5p和USP1之間的調(diào)節(jié)關(guān)系和潛在作用位點(diǎn)，結(jié)果證實(shí)了USP1是miR-192-5p在MM細(xì)胞中的靶基因的觀點(diǎn)。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-192-5p對(duì)USP1蛋白表達(dá)起到負(fù)調(diào)控作用，這也進(jìn)一步證實(shí)了miR-192-5p對(duì)USP1的靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，miR-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，通過(guò)靶向作用于USP1抑制多發(fā)性骨肉瘤的發(fā)展。因此，miR-192-5p可能是一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志物，miR-192-5p靶向調(diào)控USP1是骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)。