王芳芳，田小鵬，劉雪芹，祖航天，王 藏，胡 杰，呂明生，王淑軍*

（1.江蘇海洋大學 海洋資源與環(huán)境重點實驗室/海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222000）

右旋糖酐酶可以專一水解α-1,6糖苷鍵，應用于輕工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。在甘蔗制糖中添加右旋糖酐酶可以降低糖汁黏度，提高蔗糖質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本[1-2]。該酶具有清除口腔微生物產(chǎn)生的牙菌斑，預防齲齒的作用[3-4]。

近年來，酶法降解制備益生元-低聚寡糖具有廣闊的前景。與化學和物理法相比，酶法具有反應條件溫和、產(chǎn)物均一性好、聚合度適中、得率高、無污染、保護產(chǎn)物活性基團等優(yōu)點[5]。功能性低聚異麥芽寡糖應用于醫(yī)藥、食品和養(yǎng)殖等方面[6]。內(nèi)切右旋糖酐酶水解右旋糖酐產(chǎn)物主要為異麥芽寡糖。LIU X等[7]報道的右旋糖酐酶水解產(chǎn)物中聚合度2～7的低聚異麥芽糖的組分為91.8%，通過體外抗氧化實驗表明，可以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、超氧陰離子和羥基自由基；LIU H F等[8]報道重組菌株GH49右旋糖酐酶水解產(chǎn)物中低聚異麥芽糖的聚合度為3～6，具有促進鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌等腸道益生菌生長和抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌生長的作用。

海洋生態(tài)環(huán)境具有高鹽、堿性、低溫等特性，海洋微生物可以產(chǎn)生具有新穎特性的酶。本研究從海泥中篩選產(chǎn)右旋糖酐酶的菌株，對其進行形態(tài)學觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定，探討菌株生長特性和產(chǎn)酶條件，并采用體外實驗對酶解產(chǎn)物的組成及抗氧化活性進行研究，目的篩選出一株產(chǎn)右旋糖酐酶的海洋細菌，利用其水解產(chǎn)物制備益生元相關(guān)產(chǎn)品，為制備異麥芽寡糖提供新的酶源[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

海泥樣品：采集于連云港高公島海域。

1.1.2 化學試劑

藍色葡聚糖（Dextran blue 2000）：美國GE Healthcare公司；微生物裂解液（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）：大連Takara公司；裂解酶（TaqPCR Master Mix）：BBI生命科學有限公司；通用引物（27F、1492R）：北京Solarbio科技有限公司；右旋糖酐500鄰苯三酚（焦性沒食子酸）（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母粉（生化試劑）：英國Oxoid公司；魚粉蛋白胨、右旋糖酐20、維生素C（vitamin C，VC）、葡萄糖、麥芽糖（均為分析純或生化試劑）：國藥化學試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：德國BioFroxx公司；麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖（純度＞98%）：日本glycarbo公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、30%過氧化氫（分析純）：南京化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：酵母粉0.1%，魚粉蛋白胨0.5%，右旋糖酐20 1%，藍色葡聚糖0.2%，瓊脂2%，陳海水配制，pH 8.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：酵母粉0.1%，魚粉蛋白胨0.5%，右旋糖酐20 1%，陳海水配制，pH 8.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

右旋糖酐酶酶活力測定平板：0.1%藍色葡聚糖，1.5%瓊脂，0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉溶液（pH 5.5）配制。平板凝固后，直接使用。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博遠迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Innova 44R恒溫搖床、Multiskan Go酶標儀、Multifuge X3R高速冷凍離心機：美國Thermo公司；Freezone 6 Plus冷凍干燥機：美國Labconco公司；T100TMThermal Cycler聚合酶聯(lián)式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO RAD公司；1200 Infinity series 高效液相色譜（high per formance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)右旋糖酐酶菌株的篩選與鑒定

海泥樣品梯度稀釋10-1至10-6，取50 μL涂布于篩選培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。挑選有透明圈的單菌落純化并保藏。對菌株進行形態(tài)學觀察、生理生化指標測定及分子生物學（16S rDNA）鑒定。分子生物學鑒定：提取菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），選用原核微生物通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系為50 μL，擴增條件：94 ℃變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保藏。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海華大基因測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行相似性比較，用MEGA7.0軟件進行同源性分析并通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株生長特性研究

種子液的制備：菌株接種到種子液培養(yǎng)基，裝液量20%，180 r/min、30℃培養(yǎng)12 h，得到種子液。接種量為2%，180 r/min培養(yǎng)24 h，得到菌懸液，測定其吸光度值（OD600nm值）。

分別以碳源（麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、米糠、葡萄糖）添加量為0.5%、氮源（大豆蛋白胨、牛肉浸膏、魚粉蛋白胨、示蛋白胨和胰蛋白胨為有機氮源，硫酸銨和尿素為無機氮源）添加量為1%、初始pH為5.0～10.0、溫度為20～40 ℃、NaCl含量為0～11%，研究以上因素對菌株生長的影響。

1.3.3 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

裝液量為20%，接種量2%，180 r/min、25 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min。上清為粗酶液，檢測其右旋糖酐酶的活力。研究不同碳源（麩皮、大麥粉、可溶性淀粉、米糠和馬鈴薯淀粉）（添加量為0.1%）、不同氮源（酵母粉、豆粨、大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨和胰蛋白胨）（添加量為0.5%）、不同溫度培養(yǎng)條件（25～45 ℃）和不同初始pH（5.0～9.0）對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.4 右旋糖酐酶酶活力的測定方法

采用牛津杯法[10]測定。具體如下：將牛津杯放置在測定平板上，加入100 μL粗酶液，放置恒溫培養(yǎng)箱保溫12 h，檢測透明圈直徑，計算相對酶活，其計算公式如下：

1.3.5 酶學性質(zhì)

右旋糖酐酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性：將右旋糖酐酶液置于不同溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）反應12 h，測定酶活力。將酶液分別放置在20 ℃、30 ℃、40 ℃和45 ℃分別保溫1 h、3 h、5 h和12 h后，計算相對酶活。

右旋糖酐酶的最適pH和pH穩(wěn)定性：將右旋糖酐酶液分別放置在不同pH（乙酸-乙酸鈉緩沖液5.0～6.0；磷酸鹽緩沖液6.0～8.0；Tris-HCl緩沖液8.0～9.0）緩沖液配制的平板上，反應溫度20 ℃，12 h后測定酶活力。將酶液分別在20 ℃，pH5.0～9.0條件下保溫1 h后測定酶活，計算相對酶活。

1.3.6 高效液相色譜法檢測酶解產(chǎn)物

酶液與3%右旋糖酐500溶液（pH 6.0，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制）混合，在20 ℃條件下分別反應1 h和3 h。水浴滅酶后，12 000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)3 kDa的超濾管過濾，過0.22 μm的濾膜后用于HPLC檢測。

色譜條件：采用示差折光檢測器Waters600和Waters Sugar-Park1分析柱（6.5×300 mm）對水解產(chǎn)物鑒定和分析。流動相為超純水，流速為0.4mL/min，柱溫70 ℃，進樣量20 μL。標品為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖。

1.3.7 酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究

酶解產(chǎn)物經(jīng)3 kDa超濾后用于檢測。采用半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值反映酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，IC50值越小，其抗氧化活性越強。

（1）DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定

樣品組：在避光的EP管中依次加入150 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液和不同濃度的酶解產(chǎn)物150 μL混勻，室溫條件下反應30 min，12 000 r/min離心3 min，取200 μL的上清液檢測OD517nm值?？瞻捉M：用無水乙醇代替樣品組中的DPPH溶液。底物組：用150 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液和150 μL的超純水混勻。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Aj為樣品吸光度值；Ai為空白吸光度值；A0為底物吸光度值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

樣品組：在避光的EP管中依次加入500 μL Tris-HCl（pH 8.2，50 mmol/L）溶液和不同濃度的酶解產(chǎn)物溶液100 μL混勻，25 ℃溫育10 min，立即加入15 μL的鄰苯三酚溶液（6 mmol/L）反應30 min后，12 000 r/min離心3 min，取上清液。吸取200 μL的上清液檢測OD320nm值?？瞻捉M：用稀鹽酸（6 mmol/L）代替樣品組中的鄰苯三酚；底物組：用15 μL的鄰苯三酚溶液和500 μL Tris-HCl以及100 μL超純水混勻。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

式中：Aj為樣品的吸光度值；Ai為空白的吸光度值；A0為底物吸光度值。

（3）羥基自由基（·OH）清除率的測定

樣品組：在避光的EP管中添加100 μL不同濃度酶解產(chǎn)物和100 μL 9.9 mmol/L亞硫酸鐵溶液以及100 μL 9.9 mmol/L水楊酸-乙醇、100 μL 8.8 mmol/L雙氧水和1.1 mL去離子水混勻，37 ℃反應15 min后，12 000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清液檢測OD510nm值?？瞻捉M：用100 μL的去離子水替換雙氧水。底物組：用100 μL去離子水替代100 μL的樣品溶液。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：Aj為樣品的吸光度值；Ai為空白的吸光度值；A0為底物的吸光度值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗設(shè)3組平行；采用Origin 8.0軟件進行繪圖制作；結(jié)果均使用SPSS 26.0軟件計算并進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學觀察

通過幾輪透明圈法篩選，共獲得4株產(chǎn)透明圈菌株，編號分別為GN01、GN02、GN03和GN04。其中菌株GN02的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)見圖1。由圖1a可知，GN02菌落呈白色、圓形、不透明、表面光滑濕潤、前期邊緣整齊，后期成鋸齒狀、菌落中間有微小凸起。由圖1b可知，菌株GN02為革蘭氏陽性，無鞭毛，有莢膜，有芽孢的長桿菌，菌體大小為（3.00～5.75）μm×（0.8～1.0）μm。

圖1 菌株GN02的菌落（a）和細胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain GN02

2.1.2 生理生化試驗

菌株GN02生理生化反應結(jié)果見表1。由表1可知，菌株GN02葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、棉籽糖、甘露糖反應結(jié)果為陽性，精氨酸脫羧酶反應結(jié)果為陰性，其生理生化反應結(jié)果與芽孢桿菌屬相符。

表1 菌株GN02生理生化反應結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical reactions of strain GN02

2.1.3 分子生物學鑒定

以提取菌株GN02的DNA為模板，以27F、1492R為引物PCR擴增16S rDNA序列，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后，送上海華大基因測序，堿基長度為1 441 bp。

圖2 菌株GN02的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplified products of strain GN02

利用MEGA7.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株GN02的16S rDNA序列在NCBI上BLAST分析，與Bacillus haikouensis的同源性為97.2%。結(jié)合形態(tài)學特征和生理生化結(jié)果，鑒定菌株GN02為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株GN02的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain GN02 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 菌株GN02的生長特性

各因素對菌株GN02生長影響結(jié)果見圖4。由圖4a～圖4e可知，菌株GN02適應多種碳源，其中米糠最佳；大豆蛋白胨為最適氮源；菌株GN02在初始pH 7.0條件下生長效果最佳，在堿性環(huán)境中生長較好；菌株GN02在20～40 ℃均生長良好，最適生長溫度為35 ℃，該結(jié)果與LAI X H等[11]報道的海洋細菌Catenovulum agarivoransMNH15最適生長溫度相似；該菌在NaCl含量1%～11%范圍內(nèi)都可以生長，3%為最適生長NaCl含量，在無NaCl時不生長，表明菌株GN02為耐鹽海洋細菌[12]。綜上，菌株GN02生長的最適碳源、氮源、初始pH、溫度和NaCl含量分別為米糠、大豆蛋白胨、7.0、35 ℃和3%。

圖4 各因素對菌株GN02生長的影響Fig.4 Effect of various factors on strain GN02 growth

2.3 菌株GN02的產(chǎn)酶條件

圖5 各因素對菌株GN02產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of various factors on dextranase production by strain GN02

各因素對菌株GN02產(chǎn)酶條件影響結(jié)果見圖5。由圖5a～圖5e可知，菌株GN02產(chǎn)胞外酶，該菌株在不同碳氮源中產(chǎn)酶均較好，其中碳源為麩皮時產(chǎn)酶最高；氮源為大豆蛋白胨時產(chǎn)酶最高；菌株GN02在25 ℃培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶最高，隨著培養(yǎng)溫度的升高，產(chǎn)酶下降；在培養(yǎng)基初始pH值為8.0時，菌株GN02產(chǎn)酶量最大；在培養(yǎng)30 h后產(chǎn)酶能力開始大幅提高，48 h時產(chǎn)酶達到最高。該結(jié)果與曹研研等[13]報道的真菌產(chǎn)酶時間相比，該菌發(fā)酵產(chǎn)酶周期較短。綜上，菌株GN02產(chǎn)酶最適碳源、氮源、溫度、初始pH和時間分別為麩皮、大豆蛋白胨、25 ℃、8.0和48 h。

2.4 酶學性質(zhì)

圖6 右旋糖酐酶酶學性質(zhì)測定結(jié)果Fig.6 Determination results of enzymatic property of dextranase

由圖6a可知，該酶最適作用溫度為20 ℃，在15～40 ℃之間，可以保持80%以上的相對酶活。由圖6b可知，在20 ℃和45 ℃保溫12 h后，仍然保持90%以上和80%以上的相對酶活。由圖6c可知，該酶最適pH 7.0。由圖6d可知，在pH 7.0緩沖液中保存1 h后，相對酶活保持在90%以上。已報道的右旋糖酐酶最適溫度多在40～60 ℃[14]。NUCHAREE J等[15-17]報道的野生菌株、突變菌株和重組菌產(chǎn)酶的最適作用溫度分別為37 ℃、45 ℃、60 ℃。該右旋糖酐酶最適作用溫度相對較低。低溫酶在工業(yè)生產(chǎn)中可以節(jié)約能源。

2.5 HPLC檢測酶水解產(chǎn)物

HPLC檢測旋糖酐酶的水解產(chǎn)物，結(jié)果見圖7。由圖7可知，水解產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示，主要產(chǎn)物為異麥芽四糖和異麥芽三糖。其中，1 h水解產(chǎn)物中異麥芽四糖含量為85.6%，異麥芽三糖含量為14.3%；3 h 水解產(chǎn)物中異麥芽四糖含量82.4%，異麥芽三糖含量為13.7%。該酶可用于制備異麥芽寡糖[18]，張宇琪等[19]報道的芽孢桿菌屬產(chǎn)右旋糖酐酶的產(chǎn)物以異麥芽三糖為主。王薔等[20]報道的水解產(chǎn)物主要為異麥芽糖和異麥芽三糖。異麥芽寡糖具有提高免疫力、增殖腸道益生菌，保持食品感官品質(zhì)和抑制食品中有害菌增長的功效[21-24]。該酶水解產(chǎn)物中異麥芽四糖含量高，具有較好的應用潛力。

圖7 糖標品（a）及酶解產(chǎn)物（b）的HPLC檢測結(jié)果Fig.7 Determination results of sugar standards (a) and enzymatic hydrolysis product (b) by HPLC

2.6 酶解產(chǎn)物抗氧化活性

由圖8可知，自由基清除作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增加。清除羥基自由基的效果最好，IC50值為0.42 mg/mL，多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時清除率為92.7%。清除DPPH的效果次之，IC50值是2.98 mg/mL，多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，最大清除率為84.4%。清除超氧陰離子的IC50值為11.54 mg/mL，在20 mg/mL時的清除率為57.1%。該樣品為聚合度3～4為主的低分子量多糖，分子質(zhì)量小有利于多糖空間結(jié)構(gòu)的舒展和與自由基的結(jié)合，提高抗氧化的能力[25]。

圖8 酶解產(chǎn)物清除自由基的能力Fig.8 Free radical scavenging ability of enzymatic hydrolysis product

LIU X等[7]報道的聚合度2～7為主的低聚異麥芽糖清除超氧陰離子的IC50值約29.04 mg/mL，清除羥基自由基的IC50值約為5.32 mg/mL，IC50值分別是本研究的IC50的2.5倍和12.67倍。

3 結(jié)論

本研究從連云港海域的海泥中篩選了一株產(chǎn)內(nèi)切右旋糖酐酶的海洋細菌，經(jīng)鑒定菌株GN02為芽孢桿菌。該菌株最適生長溫度和初始pH值分別為35 ℃和7.0。該菌株產(chǎn)胞外酶，最適產(chǎn)酶溫度和初始pH分別為25 ℃和8.0，發(fā)酵時間為48 h。酶的最適溫度和pH分別為20 ℃和7.0，具有良好的熱穩(wěn)定性。酶解產(chǎn)物以異麥芽三糖和異麥芽四糖為主，1 h水解產(chǎn)物中異麥芽四糖含量達到85.6%。酶解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，清除羥基、DPPH、超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.42 mg/mL、2.98 mg/mL及11.54 mg/mL。該酶在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有較大的應用潛力。