范美榮，隨瑞枝，宋旭梅

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，寧夏 銀川 750000)

染色體病是由染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的疾病，是導(dǎo)致新生兒出生缺陷中最常見的遺傳性疾病，我國染色體病患兒占新生兒的0.5%～0.1%，主要特征為生長發(fā)育遲緩、智力低下和多器官畸形等。目前尚無有效治療方法，給社會(huì)和家庭造成了沉重的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)，僅可通過產(chǎn)前診斷預(yù)防此類患兒的出生。羊膜腔穿刺及羊水染色體核型分析是最常用且安全、可靠的侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)，是胎兒染色體疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究對7 446例妊娠中期胎兒羊水染色體核型結(jié)果及產(chǎn)前診斷高風(fēng)險(xiǎn)指征進(jìn)行了回顧性分析，以期為臨床遺傳咨詢工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2019年12月本院產(chǎn)前診斷中心收治的進(jìn)行遺傳咨詢并進(jìn)行羊水穿刺孕婦7 446例，年齡18～47歲，孕周15～27周。診斷指征包括血清學(xué)篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)、年齡高風(fēng)險(xiǎn)(生育年齡大于或等于35歲)、超聲檢測異常、夫婦一方染色體異常、無創(chuàng)基因檢測高風(fēng)險(xiǎn)、不良孕產(chǎn)史等。術(shù)前與孕婦及家屬簽署知情同意書，并充分告知羊膜腔穿刺的注意事項(xiàng)和臨床意義。

1.2方法 按傳統(tǒng)制備方法，醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹部行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，分裝在2個(gè)無菌離心管中，離心去上清液后分別接種至2個(gè)含有羊水培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至7～10 d，當(dāng)貼壁羊水細(xì)胞生長旺盛時(shí)于低倍鏡下觀察有3～5個(gè)大集落或6～8個(gè)中小集落時(shí)進(jìn)行換液。再繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d，待貼壁細(xì)胞幾乎平鋪整個(gè)培養(yǎng)瓶時(shí)加20 μg/mL秋水仙素50 μL，將羊水細(xì)胞阻留至中期分裂相。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收獲羊水細(xì)胞，經(jīng)消化、低滲、預(yù)固定、固定、制片、顯帶等步驟后進(jìn)行染色體核型分析。每例羊水標(biāo)本兩線培養(yǎng)物共計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，至少分析5個(gè)核型，異常核型加大計(jì)數(shù)和核型分析，核型按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)》命名。對部分多態(tài)性變異加做N顯帶及C顯帶檢測，以明確其性質(zhì)。本研究未將染色體多態(tài)納入異常染色體范疇。7 446例羊水培養(yǎng)中有2例為嚴(yán)重血性標(biāo)本，均只有一線成功培養(yǎng)并制備出染色體，最終用一線羊水培養(yǎng)結(jié)果發(fā)放報(bào)告并告知臨床及孕婦。

2 結(jié) 果

2.1羊水染色體核型分析結(jié)果 7 446例孕婦中檢出異常核型665例，異常檢出率為8.9%。

2.2異常染色體核型分布情況 665例異常染色體核型中檢出非整倍體異常核型419例(63.0%)，其中21-三體(包括羅氏易位型21-三體)231例(34.7%)，18-三體52例(7.8%)，13-三體4例(0.6%)，性染色體86例(13.0%)，額外微小標(biāo)記染色體6例(0.9%)，非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體40例(6.0%)，性染色非整倍體異常中包括47，XXY(Klinefelter 綜合征)35例，47，XXX(XXX綜合征)23例，47，XYY(XYY綜合征)9例，45，X(Turner 綜合征)19例。665例異常染色體核型中檢出染色體結(jié)構(gòu)異常246例(37.0%)，其中平衡性結(jié)構(gòu)異常包括平衡易位62例(9.3%)，羅伯遜易位21例(3.2%)，倒位28例(4.2%)，插入3例(0.4%)；非平衡性結(jié)構(gòu)異常包括衍生染色體39例(5.9%)，增加7例(1.0%)，缺失10例(1.5%)，環(huán)形染色體7例(1.1%)，假雙著絲粒染色體21例(3.2%)，等臂染色體16例(2.4%)，結(jié)構(gòu)異常染色體與正常核型組成的嵌合體32例(4.8%)。見表1。

表1 異常染色體核型分布情況(n=665)

2.3不同產(chǎn)前診斷指征的異常核型發(fā)生率比較 7 446例孕婦產(chǎn)前診斷指征構(gòu)成比由高至低依次為血清學(xué)篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)、年齡高風(fēng)險(xiǎn)(生育年齡大于或等于35歲)、超聲檢測異常、夫婦一方染色體異常、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)、不良孕產(chǎn)史、年齡高風(fēng)險(xiǎn)合并其他指征、其他指征(包括孕早期不良接觸史、用藥史、羊水過多/過少、患者要求等)。665例異常染色體核型中異常檢出率由高至低的產(chǎn)前診斷指征依次為NIPT高風(fēng)險(xiǎn)、夫婦一方染色體異常、年齡高風(fēng)險(xiǎn)(生育年齡大于或等于35歲)、超聲檢測異常、年齡高風(fēng)險(xiǎn)合并其他指征、血清學(xué)篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)、不良孕產(chǎn)史、其他指征。見表2。

表2 不同產(chǎn)前診斷指征的異常核型發(fā)生率比較

3 討 論

我國是出生缺陷的高發(fā)國家，根據(jù)《中國出生缺陷防治報(bào)告(2012)》的統(tǒng)計(jì)，我國出生缺陷發(fā)生率與世界中等收入國家的平均水平接近(5.6%)，每年新增加出生缺陷數(shù)為90萬例，其中出生時(shí)明顯可見的出生缺陷有25萬例。出生缺陷不但是造成兒童殘疾的重要原因，也日漸成為兒童死亡的主要原因，在全國嬰兒死因中的比例高達(dá)19.1%[1]。通過羊膜腔穿刺抽取孕中期羊水標(biāo)本進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析是最常見且安全、可靠的侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)，也是降低圍產(chǎn)兒死亡、預(yù)防異常胎兒的出生、降低出生缺陷的重要手段。本研究結(jié)果顯示，7 446例孕婦中檢出異常核型665例，異常核型檢出率為8.9%，高于國內(nèi)外其他文獻(xiàn)報(bào)道的2.8%[2]和6.7%[3]?？赡芘c本院臨床醫(yī)師及患者對產(chǎn)前診斷指征把握較為嚴(yán)格有關(guān)，同時(shí)，由于部分高風(fēng)險(xiǎn)孕婦對羊水穿刺有創(chuàng)性檢查的擔(dān)憂，往往會(huì)優(yōu)先選擇NIPT，只有NIPT 結(jié)果陽性才會(huì)繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，也在一定程度上造成了異常檢出率較高。

由表1可見，665例異常染色體核型中非整倍體異常核型419例(63.0%)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[4]。其中21-三體最多，其次為性染色體非整倍體異常和18-三體，而非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體、額外微小標(biāo)記染色體和13-三體較少。大量研究表明，非整倍體產(chǎn)生的原因主要是生殖細(xì)胞在第1次或第2次減數(shù)分裂或受精卵卵裂時(shí)發(fā)生的不分離所致，而女性隨著年齡的增長，卵巢功能退化及卵子質(zhì)量下降會(huì)使減數(shù)分裂時(shí)紡錘體發(fā)生障礙的概率增加，從而造成染色體的不分離[5]。21-三體和18-三體綜合征是最重常見的染色體非整倍體異常疾病，在新生兒中21-三體綜合征發(fā)病率為1/800～1/600，18-三體綜合征發(fā)病率為1/8 000～1/4 000，患兒均有嚴(yán)重的智力障礙，并伴多器官及組織畸形[6]。本研究中高風(fēng)險(xiǎn)孕婦21-三體發(fā)病率和18-三體發(fā)病率均顯著高于新生兒，也證明了具有高風(fēng)險(xiǎn)指征的孕婦進(jìn)行羊水染色體檢查的必要性。其中21-三體中包括羅氏易位型21-三體25例，其發(fā)病機(jī)制可能為雙親之一為羅伯遜易位攜帶者或是染色體長臂復(fù)制形成了等臂染色體[7]。目前，常染色體非整倍體異常均無有效治療辦法，因其多表現(xiàn)出嚴(yán)重出生缺陷，在產(chǎn)前診斷后需立刻終止妊娠，以避免缺陷患兒的出生。本研究檢出性染色非整倍體異常86例(13.0%)，這些性染色體非整倍體異?；純号R床表現(xiàn)主要為性腺發(fā)育不良、身高異常及生育障礙等，少數(shù)會(huì)出現(xiàn)語言行為異常及智力障礙[8]。性染色體非整倍體異常同樣無法根治，但有改善癥狀的治療方法，因此，通常臨床醫(yī)師在告知孕婦相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)后應(yīng)由其自行決定患兒去留。另外本研究中6例增加額外微小標(biāo)記染色體的胎兒經(jīng)檢查夫妻雙方染色體后2例胎兒遺傳自母親選擇繼續(xù)妊娠，4例胎兒為新發(fā)突變，新發(fā)突變病例進(jìn)一步經(jīng)微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測后，其中2例標(biāo)記染色體攜帶致病性的拷貝數(shù)變異而選擇終止妊娠，2例標(biāo)記染色體組成為隨體及異染色質(zhì)，無致病性而選擇繼續(xù)妊娠。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，80.0%的染色體結(jié)構(gòu)異常為家族遺傳，少部分為新發(fā)突變[9]。本研究結(jié)果顯示，665例異常染色體核型中檢出染色體結(jié)構(gòu)異常246例(37.0%)，其中平衡性結(jié)構(gòu)異常因不涉及遺傳物質(zhì)的增減，一般無臨床表現(xiàn)。但其中的染色體平衡易位及羅伯遜易位攜帶者在生育下一代時(shí)的生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程中平衡變異染色體可隨機(jī)形成18個(gè)不同的配子，僅有2個(gè)配子能發(fā)育為正常胚胎或相互易位型胚胎，從而會(huì)直接影響妊娠結(jié)果，出現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、生化妊娠、死胎、生育染色體病患兒等[10-11]。染色體倒位攜帶者生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中與正常同源染色體配對交換，理論上講能形成正常、倒位、部分重復(fù)或部分缺失4種不同配子，同樣會(huì)對生殖異常具有一定的遺傳學(xué)效應(yīng)，其效應(yīng)主要取決于倒位片段長度及其所含基因的致死效應(yīng)[12]。因此，此類平衡性結(jié)構(gòu)異常胎兒需結(jié)合超聲、血清學(xué)篩查等其他檢測結(jié)果綜合判定，并告知夫妻雙方進(jìn)行染色體檢查，明確染色體變異來源是遺傳自父母還是新發(fā)，如為新發(fā)還需進(jìn)一步運(yùn)用分子遺傳學(xué)技術(shù)檢測，以明確胎兒是否伴染色體微缺失或微重復(fù)。臨床醫(yī)師在進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)需告知夫婦雙方此胎兒在以后再次生育下一代時(shí)可能產(chǎn)生的影響，由夫婦雙方自主選擇繼續(xù)妊娠或終止妊娠。而非平衡性染色體異常因有遺傳物質(zhì)的增加或缺失，通常會(huì)伴有超聲檢測結(jié)果異常，此類胎兒出生后會(huì)有明顯的實(shí)質(zhì)性器官發(fā)育異常及精神發(fā)育障礙，因此，孕婦需選擇終止妊娠。

由表2可見，在產(chǎn)前診斷高風(fēng)險(xiǎn)指征中血清學(xué)篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)比例最高，其次為年齡高風(fēng)險(xiǎn)(生育年齡大于或等于35歲)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[13]。血清學(xué)篩查因其無創(chuàng)、安全、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，是35歲以下產(chǎn)婦較為普遍的篩查方法，但血清學(xué)篩查的檢出率相對較低，具有較高的假陽性和假陰性[14]。為避免漏診陽性病例，本院臨床醫(yī)師在進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)將血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)(21-三體1/1 000～1/270、18-三體1/1 000～1/350)也納入羊水穿刺產(chǎn)前診斷的高危指征。血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦生育異?；純旱母怕氏噍^于其他指征低，故本研究中血清學(xué)篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)指征比例高達(dá)32.5%，而異常核型僅檢出20例，異常核型檢出率為0.8%，明顯低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15]。20例異常核型中21-三體10例，18-三體2例，性染色體數(shù)目異常2例，其他異常核型6例，也表明產(chǎn)前血清學(xué)篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)不僅可檢出21-三體、18-三體和神經(jīng)管畸形患兒，對性染色體數(shù)目異常及染色體結(jié)構(gòu)異常也具有一定的預(yù)警作用。

臨床將預(yù)產(chǎn)年齡大于或等于35歲的孕婦稱為高齡孕婦，近年來，隨著“二孩”政策的全面開放，高齡孕婦比例逐年升高。NEAGOS等[15]研究表明，在40～45歲孕婦中生育21-三體的比例高于25～30歲孕婦。CRANDALL等[16]研究表明，20歲女性生育21-三體的概率為1/2 000，但當(dāng)母親45歲時(shí)其概率則增加至1/40。因此，對高齡孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺和胎兒染色體核型分析非常有必要。由表2也可見，單純高齡孕婦異常檢出率(6.6%)明顯低于高齡合并其他指征的異常檢出率(24.7%)，表明高齡孕婦如合并其他產(chǎn)前診斷檢測指征會(huì)大大增加發(fā)生胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)。由表2還可見，產(chǎn)前診斷高風(fēng)險(xiǎn)指征中異常核型檢出率最高的指征為NIPT高風(fēng)險(xiǎn)(48.0%)，與BENN等[17]研究結(jié)果一致，說明NIPT對胎兒染色體核型異常特別是對21-三體的檢出方面具有較高的準(zhǔn)確性。NIPT技術(shù)因具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性、檢查時(shí)間早、靈敏度高、有商業(yè)保險(xiǎn)賠付等優(yōu)勢，近年來，廣泛用于胎兒21、18、13-三體及性染色體非整倍體異常的篩查。本研究中 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的產(chǎn)前診斷指征共檢出異常核型179例，其中21-三體85例，18-三體16例，性染色體數(shù)目異常40例，其他染色體異常38例，與國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[18]。表明NIPT 技術(shù)不同于目前的血清學(xué)篩查，對常見非整倍體染色體異常具有較高的靈敏度和特異度，同時(shí)，對其他染色體異常也可做出預(yù)警。但值得注意的是NIPT技術(shù)只能作為高精度的篩查技術(shù)，還不能作為臨床診斷技術(shù)，對NIPT篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦必須再次進(jìn)行羊水穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

當(dāng)夫婦一方染色體異常作為產(chǎn)前診斷高風(fēng)險(xiǎn)指征時(shí)通常為夫婦之一為平衡易位或倒位等平衡性結(jié)構(gòu)異常攜帶者，此時(shí)生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中可隨機(jī)形成正常或異常配子，胎兒有極大的可能形成非平衡性結(jié)構(gòu)異常。本研究中夫婦一方染色體異常相關(guān)高風(fēng)險(xiǎn)指征共檢出4例21-三體，1例18-三體，4例性染色體數(shù)目異常和149例其他染色體異常。也提示存在染色體異常夫婦在生育下一代時(shí)進(jìn)行羊膜腔穿刺是非常有必要的。目前，羊水染色體分析結(jié)合超聲診斷已成為產(chǎn)前診斷中最常用的方法，超聲檢測異常包括胎兒心臟異常、胎兒頸項(xiàng)透明層增厚，肢體發(fā)育不良、脈絡(luò)叢囊腫等一項(xiàng)或多項(xiàng)軟指標(biāo)異常。本研究中孕中期超聲檢測異常81例，異常核型檢出率為6.7%，低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19]；這是因?yàn)楸驹横槍Σ糠忠贿^性超聲檢測異常孕婦先建議其選擇NIPT檢測，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)者再進(jìn)一步做羊膜腔穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

本研究中出現(xiàn)40例非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體，以及32例染色體結(jié)構(gòu)異常核型與正常核型組成的嵌合體。羊水染色體的嵌合體存在真假性嵌合，胎兒本身的嵌合為真性嵌合，真性嵌合發(fā)生的概率往往比較低，會(huì)對胎兒智力、生長發(fā)育造成影響。而假性嵌合是由羊膜腔穿刺過程中的母體細(xì)胞污染、胎兒細(xì)胞有絲分裂異常及羊水細(xì)胞突變等因素所致，需進(jìn)一步給予臍帶血染色體核型檢查以驗(yàn)證真假性嵌合。本研究經(jīng)與臍帶血染色體核型檢查結(jié)果比較，40例非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體中有8例真性嵌合和11例假性嵌合，32例染色體結(jié)構(gòu)異常核型與正常核型組成的嵌合體中有5例真性嵌合和10例假性嵌合。其他患兒因嵌合比例較低及其他個(gè)人原因未給予臍帶血染色體核型分析驗(yàn)證，本研究也未追蹤到其妊娠結(jié)局。胎兒真性嵌合的臨床表型取決于嵌合體中異常核型比例、異常核型類型和所涉及基因組大小和功能等，另外也需參考超聲檢測及家族史等各項(xiàng)內(nèi)容，進(jìn)行充分的遺傳咨詢并告知患者可能的風(fēng)險(xiǎn)，由其家屬自行決定繼續(xù)妊娠或終止妊娠。

綜上所述，對產(chǎn)前診斷高風(fēng)險(xiǎn)指征孕婦進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析可及時(shí)檢測出染色體異常胎兒，有效降低新生兒出生缺陷發(fā)生率，從而達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。