楊秀偉，劉曉艷，崔澤旭

北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191

雞血藤Spatholobi Caulis為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖[1]，主產(chǎn)于中國云南、廣西等地，在緬甸、印度尼西亞等熱帶地區(qū)也有分布。在傳統(tǒng)功效上，雞血藤可補血活血、舒筋活絡(luò)，治療月經(jīng)不調(diào)、腰膝酸軟、風濕痹痛等癥，凡婦人血瘀及血虛之月經(jīng)病證均可應(yīng)用，且多為配伍應(yīng)用。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥繼承、發(fā)展和創(chuàng)新的關(guān)鍵科學問題[2]。本課題組報道了雞血藤部分化學成分的研究和抗炎活性[3-5]，從雞血藤中分離得到1個新的降倍半萜類化合物。本研究應(yīng)用核磁共振(NMR)確定這個新化合物的化學結(jié)構(gòu)為布盧門醇A-6-O-反式-對羥基肉桂酸酯(blumenol A-6-O-trans-p-hydroxycinnamate)。

1 材料

1.1 試藥

雞血藤藥材采自中國云南省普洱市，由株洲千金藥業(yè)有限公司提供。經(jīng)北京大學藥學院楊秀偉教授鑒定為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖。憑證標本(標本號：Y008-1608010)保存于北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。

分析純甲醇(MeOH)、乙酸乙酯(EtOAc)、三氯甲烷(CHCl3)、正丁醇(n-BuOH)等為北京化工廠產(chǎn)品；色譜純甲醇和乙腈(ACN)為美國Fisher Chemical產(chǎn)品；實驗用去離子水由Milli-pore Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備純化而得。

1.2 儀器

AV 400型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)，三甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標；LC 3000型反相制備高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，配置P3050型二元泵、CXTH-3000型色譜工作站；色譜柱為Phenomenex Prodigy ODS(250 mm × 21.2 mm，10 μm，美國Phenomenex公司)；GF254薄層色譜(TLC)硅膠板為青島海洋化工廠和德國Merck公司產(chǎn)品；200～300目柱色譜用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

2 提取與分離

稱取干燥雞血藤藥材70 kg，加5倍量水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮，75 ℃真空干燥7 h，得雞血藤干浸膏6 kg(收率為8.57%)，留存1 kg，其余5 kg用6 L去離子水溶解，依次用適量EtOAc、n-BuOH各萃取8次，分別合并各萃取液，減壓濃縮蒸干，得EtOAc萃取物320 g(按投料生藥計算收率為0.46%，下同)、n-BuOH萃取物500 g(收率0.86%)和殘存水層。

EtOAc萃取物(270 g)進行硅膠柱色譜分離，用CHCl3-MeOH體系(80∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1)依次梯度洗脫，得組分Fr.1～Fr.7。Fr.3(5.68 g)經(jīng)TLC檢識，硅膠柱色譜分離，CHCl3-MeOH(20∶1、15∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脫，TLC檢測合并相同組分，得組分Fr.3-1～Fr.3-4。Fr.3-2經(jīng)硅膠柱色譜分離，CHCl3-MeOH(10∶1→2∶1)梯度洗脫，得組分Fr.3-2-1～Fr.3-2-3。Fr.3-2-1經(jīng)反相硅膠制備高效液相色譜(ACN-H2O，12∶88，8 mL·min-1)制備分離、純化，得化合物1(20.0 mg，tR為32.1 min)。

3 化合物結(jié)構(gòu)的NMR分析

化合物1為淡黃色粉末(EtOAc)。分析其1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)和13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)波譜，顯示出6，9-二氧代大柱香波龍烷-4，7-二烯-3-酮(6，9-dioxygened megastigmane-4，7-diene-3-one)骨架[6]。用1H-1H COSY(1H-1H correlation spectroscopy)、HSQC(heteronuclear single quantum coherence)和HMBC(heteronuclear multiple-bond correlation)相關(guān)譜確認了骨架。在化合物1的1H-NMR 和1H-1H COSY譜中，觀察到4個甲基信號(表1)：δH0.91(3H，s，H-12)，0.94(3H，s，H-11)，1.12(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)，1.81(3H，d，J=1.1 Hz，H-13)；從其HSQC譜確定相應(yīng)碳的化學位移分別為δC24.2q(C-11)、23.3q(C-12)、24.3q(C-10)、19.3q(C-13)；1個亞甲基信號，δH2.36(1H，d，J=16.7 Hz，Ha-2)和2.06(1H，d，J=16.7 Hz，Hb-2)，從其HSQC譜確定相應(yīng)碳的化學位移為δC49.7t(C-2)；3個烯質(zhì)子，分別為δH5.65(1H，d，J=15.7 Hz，H-7)、5.71(1H，dd，J=15.7，4.5 Hz，H-8)和5.78(1H，d，J=1.1 Hz，H-4)，從其HSQC譜確定相應(yīng)碳的化學位移分別為δC128.2d(C-7)、136.1d(C-8)和125.8d(C-4)；從1H-1H COSY譜觀察到δH5.65→δH5.71→δH4.19(1H，dt，J=6.4，4.5 Hz，H-9)→δH1.12(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)處于1個自旋耦合體系中(圖1)，且從1H-NMR譜觀察到δH5.65(1H，d，J=15.7 Hz，H-7)與δH5.71(1H，dd，J=15.7，4.5 Hz，H-8)有較大的耦合常數(shù)，為反式雙鍵的質(zhì)子信號[7]；烯質(zhì)子信號δH5.78具有小的耦合常數(shù)(1H，d，J=1.1 Hz)，判斷與烯鍵連接的甲基質(zhì)子處于W型遠程耦合，即H-4與C-5甲基質(zhì)子處于同一個平面，且2個質(zhì)子構(gòu)成伸展的W型，在空間上很接近，發(fā)生遠程耦合[8-9]；結(jié)合HMBC實驗(圖1)，δH0.94與δC23.3q、41.2s、49.7t、78.1s，δH0.91與δC24.2q、41.2s、49.7t、78.1s呈HMBC相關(guān)性，因此，CH3-11和CH3-12同時與C-1(δC41.2)相連，又由于在HSQC實驗中δH2.36(Ha-2)和2.06(Hb-2)與δC49.7t直接相連，因此，δC78.1s應(yīng)該歸屬為C-6；由于在HMBC實驗中觀察到δH2.36(Ha-2)和2.06(Hb-2)與δC197.6s有相關(guān)性，證明其必定是C-3的化學位移值；同時觀察到δH5.78(1H，d，J=1.1 Hz)與δC197.6s有HMBC相關(guān)性，亦與δC19.3q有HMBC相關(guān)，結(jié)合在HSQC實驗中δH5.78直接與δC125.8d相連，δH1.81(3H，H3-3)直接與δC164.7s相連，證明δC125.8d和δC164.7s應(yīng)分別歸屬為C-4和C-5；又由于在HMBC實驗中δH5.78與δC78.1s呈HMBC相關(guān)性，合理地解釋了δC78.1s必定歸屬為C-6，亦提示C-6可能與電負性較強的氧元素相連。

表1 化合物1的1H-(400 MHz)和13C-(100 MHz)NMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6)

圖1 化合物1主要的1H-1H COSY(-)和HMBC(→)相關(guān)

如前所述，δH5.65→δH5.71→δH4.19→δH1.12處于1個自旋耦合體系中，在HSQC實驗中觀察到δH5.65(H-7)/δC128.2d(C-7)、δH5.71(H-8)/δC136.1d(C-8)、δH4.19(H-9)/δC66.4d(C-9)、δH1.12(H-10)/δC24.3q(C-10)的關(guān)系，推論出C-6結(jié)合(1E，3R)-3-羥基-1-丁烯基[(1E，3R)-3-hydroxy-1-butenyl][1H-NMR：δH5.65(1H，d，J=15.7 Hz，H-7)，5.71(1H，dd，J=15.7，4.5 Hz，H-8)，4.19(1H，dt，J=6.4，4.5 Hz，H-9)，1.12(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)；13C-NMR：δC128.2d(C-7)，136.1d(C-8)，66.4d(C-9)，24.3q(C-10)]，除C-6的化學位移外，與合成和天然的(6S，9R)-催吐蘿芙木醇[(6S，9R)-vomifoliol]，即布盧門醇A(blumenol A)數(shù)據(jù)基本一致[10-11]。

另一方面，在化合物1的1D-NMR和2D-NMR譜中，多出1組典型的反式-對羥基肉桂?；?trans-p-hydroxycinnamyl)信號[5，12][1H-NMR：δH7.48(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.79(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，7.49(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，6.29(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，10.10(1H，brs，4′-OH)；13C-NMR：δC125.6s(C-1′)，130.3d(C-2′，6′)，116.0d(C-3′，5′)，159.9s(C-4′)，144.2d(C-7′)，116.0d(C-8′)，168.4s(C-9′)]。與(6S，9R)-催吐蘿芙木醇或布盧門醇A[11]的13C-NMR化學位移值比較，C-9幾乎沒有變化，C-6發(fā)生了變化。因此，化合物1是布盧門醇A(2)的C-6羥基與反式-對羥基肉桂酸(3)的羧基發(fā)生酯化的產(chǎn)物(圖2)，化學結(jié)構(gòu)為布盧門醇A-6-O-反式-對羥基肉桂酸酯(blumenol A-6-O-trans-p-hydroxycinnamate)或(6S，9R)-催吐蘿芙木醇-6-O-反式-對羥基肉桂酸酯[(6S，9R)-vomifoliol-6-O-trans-p-hydroxycinnamate]。該化合物為新化合物，化學結(jié)構(gòu)見圖2，根據(jù)其1H-1H COSY、HSQC和HMBC實驗進行了質(zhì)子和碳信號的全歸屬，見表1。

圖2 化合物1可能的來源途徑及化學結(jié)構(gòu)

4 討論

雞血藤的物質(zhì)基礎(chǔ)化學結(jié)構(gòu)類型具有多樣性[3-5]，僅在黃酮類化合物中就有二氫黃酮、異黃酮、二氫異黃酮、查耳酮等，尤其是特征性成分異黃酮類化合物，是其重要的生物活性物質(zhì)[3]。本研究又分離鑒定出1個新的降倍半萜類化合物，根據(jù)2D-NMR確定了這個新化合物的化學結(jié)構(gòu)為布盧門醇A-6-O-反式-對羥基肉桂酸酯，進一步豐富了雞血藤物質(zhì)基礎(chǔ)化學結(jié)構(gòu)類型的多樣性。根據(jù)文獻類似結(jié)構(gòu)化合物生物活性的報道[8]，預(yù)測化合物1可能具有抗炎活性。

早在2012年，從雞血藤中就分離鑒定出了降倍半萜類的布盧門醇A[13]，其后又分離鑒定出了更多的該類化合物[14]。最近，從雞血藤中分離鑒定出反式-對羥基肉桂酸[5]，從而推斷新化合物1可能是布盧門醇A的C-6上的羥基與反式-對羥基肉桂酸的羧基在酯酶作用下脫水形成的酯。中藥通常為口服給藥，且酯類化合物經(jīng)過腸內(nèi)時被豐富的酯酶所水解[15]，因此，布盧門醇A-6-O-反式-對羥基肉桂酸酯經(jīng)腸可能釋放出布盧門醇A而被吸收進入體內(nèi)，發(fā)揮生物學效用。文獻報道布盧門醇A對人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7、人結(jié)腸癌HT-29、人腎癌A498、人前列腺癌PC-3、人胰腺癌PACA-2等細胞株的增殖具有一定的細胞毒活性，半數(shù)有效濃度分別為11.3、12.3、14.5、16.6、24.3、19.6 μg·mL-1[16]；具有抗氧化和抗乙酰膽堿酯酶活性[17]。因此，布盧門醇A-6-O-反式-對羥基肉桂酸酯也許是雞血藤潛在的生物活性成分之一，需要進一步驗證。