李欣欣，張凱，王麗霞，柴沖沖，陳冬玲，魏龍吟，尹貽慧，常永卓，李飛*，楊輝*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院，北京 100083；3.北京豐臺醫(yī)院，北京 100070

附子是毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品，辛、甘，大熱，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效[1]?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版收錄了黑順片、白附片、淡附片和炮附片4種附子的炮制品。其中，黑順片在醫(yī)院藥房較為常見，用于亡陽證、陽虛證及痹痛[2]?！吨袊幍洹?015年版對黑順片的味道描述為“味淡”。

筆者在對多批市售黑順片口嘗后發(fā)現(xiàn)，味淡者極少，多為咸澀或有麻舌感。黑順片味咸澀，與加工過程中膽巴漂洗不充分使其殘留量多有關(guān)。膽巴對胃有腐蝕作用，其中的鎂離子對心血管及神經(jīng)系統(tǒng)均有抑制作用[3]。而麻舌感與毒性成分雙酯型生物堿含量偏高有關(guān)[4]。在成分含量未知的情況下，口嘗黑順片可能危害操作人員健康，且人工口嘗因個體差異具有主觀性。電子舌技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種分析、識別液體味道的新型檢測手段，利用多根高度敏感的味覺傳感器評判味道，其測定結(jié)果客觀、可重復(fù)[5]。將電子舌技術(shù)應(yīng)用于毒性飲片的滋味評價可杜絕對操作人員的潛在危害。該技術(shù)能否判別黑順片的滋味是否符合《中國藥典》2015年版“味淡”標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)并無相關(guān)報道。

本研究以市售黑順片為對象，采用口嘗評價和電子舌檢測飲片“味道”，采用主成分分析(PCA)和Fisher模型對電子舌響應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用偏最小二乘法(PLS)建立口嘗評價和電子舌響應(yīng)值的關(guān)系模型，建立電子舌CTS(咸)傳感器與膽巴含量線性回歸方程，以期分析味道檢測在黑順片的質(zhì)量評價中的實用價值。

1 材料

1.1 儀器

ASTREE電子舌，包含AHS(酸)、PKS(通用)、CTS(咸)、NMS(鮮)、CPS(通用)、ANS(甜)、SCS(苦)7根交叉敏感電位傳感器陣列，Ag/AgCl 參比電極，16位自動進(jìn)樣器，均購于法國Alpha MOS公司；SB25-12型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BSA224S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 樣品

本研究黑順片樣品分別來自北京23家社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、3家二級醫(yī)院、5家三級醫(yī)院及安國市場和四川江油中壩有限公司，最終整合廠家和批次，編號為S1～S32。其中，S12為國家抽檢合格品。飲片均粉碎過三號篩備用。經(jīng)廣安門醫(yī)院王建升主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品。

1.3 試藥

氯化鈉、谷氨酸鈉和鹽酸(法國Alpha MOS公司)均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 膽巴含量的測定

分別稱取各批次黑順片樣品粉末，參照文獻(xiàn)方法[6]制備供試品溶液并進(jìn)行膽巴含量的測定，測定結(jié)果見表1。

表1 各批次黑順片膽巴含量和口嘗評價結(jié)果(n=3)

2.2 口嘗評價方法及結(jié)果

2.2.1志愿者的篩選 從20名志愿者中隨機(jī)選擇8名作為小組成員(4名男性和4名女性，平均年齡24歲，無嚴(yán)重過敏、遺傳病史，無膽囊炎，無不良嗜好及近期無疾病史)對32批黑順片進(jìn)行口嘗評價。

2.2.2口嘗指標(biāo)及評分范圍的確認(rèn) 小組成員口嘗黑順片粉末，以識別和記錄所有的味道屬性，成員之間討論并確定了屬性，然后依據(jù)《BS ISO 4121：2003 Sensory analysis-Guidelines for the use of quantitative response scales》，建立了最終的口嘗指標(biāo)。

參照文獻(xiàn)[7-8]，結(jié)合黑順片的特點，確定口嘗描述評分結(jié)果為0(未檢測到)～9(非常強(qiáng)烈)，具體評分結(jié)果見表2。以S12國家抽檢合格飲片味道“味淡”為準(zhǔn)，無麻舌感、無澀味、無苦味、微咸，感官總評分≤5，口感綜合描述為“味淡”。

表2 口嘗評價黑順片中苦味和麻舌感的定性描述和評分范圍

2.2.3口嘗評價方法 口嘗評價方法參照文獻(xiàn)[9]，采用評分法對32批黑順片進(jìn)行評估。在評定前4 h，小組成員不得抽煙飲酒，不得食用具有嚴(yán)重氣味的食物。將2 g準(zhǔn)備好的黑順片粉末放入玻璃杯中，以拉丁方塊的順序送到受試者面前。從杯中每次取樣量100 mg，置于舌前1/3處，在口中嚼30 s。小組成員對每個樣本的每個屬性的感知強(qiáng)度進(jìn)行評分，并做出綜合的口嘗描述。每次口嘗前，小組成員用純凈水漱口5次，并間隔15 min，至口腔中無麻、辣等味覺后進(jìn)行口嘗。每個樣品的口嘗評估一式三份進(jìn)行，結(jié)果以均值計算。

2.2.4口嘗評價結(jié)果 8位口嘗小組成員針對6種口嘗屬性(酸、甜、苦、澀、咸和麻舌感)評估的口嘗評分的統(tǒng)計結(jié)果見表2，口感描述參照2.2.2項下中評分范圍。由表2可知，32批市售黑順片口嘗差異較大。S12、S29～S32 5批飲片口感描述為“味淡”，與《中國藥典》2015年版中黑順片的描述“味淡”相符合；其余27批次樣品的口感描述與《中國藥典》2015年版均有較大差異。

2.3 電子舌檢測方法及結(jié)果

2.3.1電子舌檢測方法 先以0.01 mol·L-1氯化鈉、0.01 mol·L-1谷氨酸鈉對電子舌傳感器進(jìn)行診斷，診斷通過后，以0.01 mol·L-1鹽酸對電子舌進(jìn)行預(yù)平衡，平衡通過后開始檢測，對每份樣品檢測120 s，每份樣品重復(fù)檢測9次，每秒檢測1個數(shù)據(jù)。每檢測1個樣品，清洗時間30 s，取后6次數(shù)據(jù)的均值作為測試結(jié)果。

2.3.2供試品溶液的制備 按參考文獻(xiàn)[10]方法，取市售32批黑順片，粉碎，過三號篩，精密稱取50 mg，加蒸餾水50 mL，超聲處理(功率：500 W，頻率：40 Hz)10 min，放冷，濾過。精密量取濾液25 mL，置檢測用燒杯中，備用。

2.3.3方法學(xué)考察

2.3.3.1精密度試驗 取S1黑順片樣品供試品溶液，按2.3.1項下方法連續(xù)檢測6次，記錄傳感器AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS的響應(yīng)值，計算RSD分別為1.65%、2.35%、1.80%、1.98%、2.37%、1.54%、2.33%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.2重復(fù)性試驗 取S1黑順片樣品粉末50 mg，精密稱定，平行制備供試品溶液6份，分別檢測，記錄傳感器AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS的響應(yīng)值，計算RSD分別為1.73%、2.14%、2.03%、1.99%、2.21%、2.01%、1.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.3穩(wěn)定性試驗 取S1黑順片樣品供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、12、16、24 h檢測，記錄傳感器AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS的響應(yīng)值，計算RSD分別為2.07%、2.42%、2.26%、1.39%、2.28%、2.11%、2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4黑順片味道檢測 分別取各批次黑順片粉末，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下方法檢測，記錄傳感器AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS的響應(yīng)值，黑順片各傳感器響應(yīng)值雷達(dá)圖見圖1。

圖1 黑順片電子舌響應(yīng)值雷達(dá)圖

2.4 電子舌響應(yīng)值分析

2.4.1PCA比較市售黑順片味道差異 本研究以7根傳感器的響應(yīng)值為變量，采用SIMCA-P軟件對32批黑順片進(jìn)行PCA，標(biāo)度化(scaling)方式選為中心化(ctr)。分析結(jié)果顯示，貢獻(xiàn)率最大的2個主成分，累積貢獻(xiàn)率超過80%，表明前2個主成分能夠充分體現(xiàn)出黑順片的基本特征和主要信息。因此，本研究以前2個主成分為坐標(biāo)軸構(gòu)建主成分平面，將樣本的多元變量通過降維的方式投影在二維平面上，以觀察樣本的整體分布情況和各變量對樣本分布的貢獻(xiàn)大小，各批次樣品經(jīng)過PCA后得分圖見圖2。

圖2 各批次黑順片PCA得分

前2個主成分累積貢獻(xiàn)率超過80%，表明PCA所建立的模型具有良好的預(yù)測能力。圖2顯示，黑順片被分為兩類，“味淡”的5批飲片S12、S29～S32集中在第二象限，其余批次飲片，除S13外，均集中在第一、三、四象限，分布相對集中。結(jié)合口嘗評價可知，S13飲片苦味值、咸味值及麻舌感與S12國家抽檢合格飲片接近，且無澀味，感官總評分在“非味淡”飲片中最低。因此，S13與“味淡”飲片在PCA分布圖上顯示距離較為接近。結(jié)果表明，PCA可用于區(qū)分鑒別黑順片中“味淡”飲片與“非味淡”飲片。

2.4.2Fisher判別模型分析市售黑順片“味道”差異 采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件對“味淡”的5批飲片S12、S29～S32，與其他市售27批黑順片的電子舌響應(yīng)值做Fisher判別分析。其中，7根傳感器響應(yīng)值作為觀察值，記為X1～X7，判別函數(shù)值記為Y，得到判別函數(shù)為Y=468.709X1+139.231X2+203.819X3+81.005X4+133.919X5+345.925X6+387.532X7，卡方檢驗及精確F檢驗P值均小于0.001，表明該判別方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。計算判別界值Z為4 817 078.24，將YZ時判為非“味淡”飲片。判別結(jié)果顯示，總判錯數(shù)為0，表明其對黑順片是否符合“味淡”要求能進(jìn)行有效判別，判別識別率為100%。

2.5 口嘗評分和電子舌響應(yīng)數(shù)據(jù)的PLS

為了驗證口嘗評分和電子舌響應(yīng)數(shù)據(jù)的關(guān)系，分別以口嘗評分和電子舌數(shù)據(jù)作為X矩陣和Y矩陣，建立了PLS模型。前2個因素(t1和t2)解釋了交叉驗證方差的80.70%，結(jié)果如圖3所示，口嘗評價的咸味與CTS傳感器在同一象限且距離最近，苦味與SCS傳感器在同一象限且距離最近，表明，電子舌的SCS和CTS傳感器與口嘗的苦味和咸味有很好的對應(yīng)關(guān)系。

注：紅色點代表口嘗評價指標(biāo)；藍(lán)色點代表電子舌傳感器響應(yīng)數(shù)據(jù)。

2.6 電子舌CTS傳感器與膽巴含量的相關(guān)性分析

口嘗評價中大多飲片均不符合《中國藥典》2015年版“味淡”的描述。S32樣品的膽巴殘留量最低，且味覺評價為“味淡”；S3樣品的膽巴殘留量最高，味覺評價的描述為“咸味強(qiáng)烈，麻舌感持久”，其CTS傳感器響應(yīng)值偏高。用Pearson相關(guān)對電子舌CTS傳感器響應(yīng)數(shù)值及32批黑順片膽巴含量間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，CTS傳感器響應(yīng)數(shù)值與膽巴含量之間r為0.935，呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。以CTS傳感器響應(yīng)值為X，膽巴含量為Y，進(jìn)行一元線性回歸分析，所得方程：Y=-19.013+0.025X，r=0.930 4，F(xiàn)=37.24，P=0.001 8<0.01，表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上分析表明，膽巴含量和電子舌CTS傳感器有顯著正相關(guān)關(guān)系，且通過回歸方程，電子舌CTS傳感器響應(yīng)值可快速確定黑順片中膽巴含量。

2.7 驗證實驗

在32批樣品之外，另隨機(jī)選用3批未知生物堿含量的黑順片飲片，按2.1項下方法測定膽巴含量，按2.2.3項下方法進(jìn)行口嘗評價，結(jié)果見表3。按2.3.1項下電子舌檢測條件對其“味道”量化檢測，結(jié)果見表4。

表3 3批黑順片膽巴含量和口嘗評價結(jié)果(n=3)

表4 3批黑順片電子舌檢測結(jié)果(n=6)

將表4中3批黑順片電子舌響應(yīng)值代入Fisher判別模型，Y分別為Y1=5 374 134.19>Z，Y2=5 159 050.06>Z，Y3=4 120 844.19

將表4中3批黑順片CTS傳感器響應(yīng)值(X)代入回歸方程Y=-19.013+0.025X，所得3批樣品膽巴質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y)分別為9.390%、3.758%、1.597%，與實測值(表3)相差保持在±0.402%以內(nèi)，證明由電子舌傳感器響應(yīng)值代入回歸方程計算黑順片中膽巴含量，推測其膽巴殘留量結(jié)果穩(wěn)定可信。

3 討論

本研究采用電子舌技術(shù)對黑順片滋味進(jìn)行檢測，PCA和Fisher模型可對黑順片是否符合《中國藥典》2015年版“味淡”的要求進(jìn)行快速準(zhǔn)確地辨別。將電子舌檢測所得CTS傳感器響應(yīng)值代入線性回歸方程，可準(zhǔn)確預(yù)測膽巴含量。電子舌為黑順片中膽巴殘留量的控制提供了快速有效的手段。故電子舌技術(shù)可以作為現(xiàn)有質(zhì)量控制指標(biāo)的補(bǔ)充，以保證臨床用藥的安全，味道檢測在黑順片質(zhì)量評價中具有實用價值。

物質(zhì)的可溶性部分刺激味蕾產(chǎn)生味覺[11-12]。將粉末溶于水，通過電子舌檢測可代表黑順片中水溶性部分的味道。且黑順片在炮制過程中經(jīng)過長時間浸泡腌制、水煮和蒸制，所含淀粉已經(jīng)全部轉(zhuǎn)化為糊化淀粉，口嘗過程中未產(chǎn)生沙粒感和吸收口腔唾液較強(qiáng)的情況。采用粉末口嘗有利于樣品成分充分混勻，確保結(jié)果的客觀性、均一性和可重復(fù)性。

黑順片口嘗評價結(jié)果顯示，酸味和甜味值為0，苦味值口嘗評分較低，而電子舌AHS、ANS、SCS傳感器響應(yīng)值較強(qiáng)，可能是由于黑順片具有雙酯型生物堿等麻痹的成分，味蕾被短暫可逆地麻痹，短時間內(nèi)感覺不到藥物的味道[13]。電子舌傳感器數(shù)值與傳統(tǒng)口嘗味覺指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析表明，黑順片口嘗的苦味、咸味與電子舌的傳感器有很好的對應(yīng)關(guān)系。而傳統(tǒng)口嘗對象為飲片，所產(chǎn)生的味覺更全面，如口嘗評價中的麻舌感、澀味等電子舌未有傳感器與之對應(yīng)。因此，電子舌不能完全取代口嘗，可用于味覺評價的補(bǔ)充。