孫健，任江劍a，華金渭，沈曉霞，王志安

1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2.麗水市農(nóng)林科學研究院，浙江 麗水 323000

覆盆子為掌葉覆盆子RubuschingiiHu的干燥未成熟果實，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目之功效[1]，臨床上常用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、陽痿早泄、目暗昏花[2]，主要分布于我國華東地區(qū)的浙江、廣西、江西和福建等省?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和血脂、抗衰老和抗炎等藥理作用[3-4]。分子鑒定技術(shù)在中藥材基原的區(qū)分和偽品鑒別中可以起到定性判別的作用[5]，其中以核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列和葉綠體psbA-trnH應用最多[6-7]。物種內(nèi)部不同地理宗、居群或品種的區(qū)分需要更多的基因信息進行區(qū)分，對于無參考基因組的植物，往往采用隨機引物進行初步的研究，如相關序列擴增多態(tài)性(SRAP)、簡單重復間序列(ISSR)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)等標記體系。其中，ISSR分子標記是全基因組多樣性分析的通用標記，具有多態(tài)性高、操作簡便等優(yōu)點，至今仍用于植物群體遺傳組成的初步分析[8-11]。近年，浙江及周邊省份覆盆子產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，人工引種栽培面積超過8萬畝(1畝≈666.67 m2)，而有關覆盆子資源的系統(tǒng)分析未見報道。本研究系統(tǒng)記錄了華東地區(qū)24份掌葉覆盆子資源的主要表型，利用ISSR標記對華東產(chǎn)區(qū)掌葉覆盆子與其近似種進行遺傳分析，明確了掌葉覆盆子與懸鉤子屬近緣植物紅樹莓R.idaeusL.、茅莓R.parvifoliusL.、山莓R.corchorifoliusL.f.、三花懸鉤子R.trianthusFocke、盾葉莓R.peltatusMaxim.的親緣關系和掌葉覆盆子種內(nèi)的遺傳多樣性特征，為掌葉覆盆子的基原鑒定和新品種選育提供參考。

1 材料

1.1 樣品

2017年收集華東各地的野生掌葉覆盆子資源24份，收集近緣的懸鉤子屬植物5份。其中，1份樹莓樣品為國外引種的紅樹莓R.idaeus栽培種，山莓和茅莓采集自于杭州市西湖區(qū)，三花懸鉤子采集于臺州市石梁鎮(zhèn)，盾葉莓采集于杭州市藻溪鎮(zhèn)。各樣品統(tǒng)一栽培于麗水市農(nóng)科院試驗基地。2019年開花后，植物基原由麗水市農(nóng)林科學研究院華金渭研究員鑒定，結(jié)合花器官表型[12]和ITS序列信息(分子鑒定參考呂群丹等[13]方法)鑒定為掌葉覆盆子RubuschingiiHu、紅樹莓R.idaeusL.、茅莓R.parvifoliusL.、山莓R.corchorifoliusL.f.、三花懸鉤子R.trianthusFocke、盾葉莓R.peltatusMaxim.。24份掌葉覆盆子材料來源和表型見表1。

表1 掌葉覆盆子來源和表型特征

1.2 試藥

聚合酶鏈式反應(PCR)擴增試劑為2×HieffTMPCR Plus Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)。三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇、三氯甲烷、異戊醇均為分析純，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器

Veriti 96 Well Thermal cycler型PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Gel DocTMXR+型凝膠成像儀、PowerPac Basic型電泳儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)；Legend Micro 17型高速離心機(美國Thermo公司)；M200 Pro型多功能酶標儀(美國Tecan公司)；Tissue Lyser Ⅱ型組織研磨器(德國Qiagen公司)。

2 方法

2.1 表型記錄

參考同屬植物樹莓和月季的表觀性狀分類體系[14-15]，結(jié)合掌葉覆盆子生物學特征，選取8個表觀性狀進行觀察記錄。每份樣品隨機選取5個單株，群體內(nèi)質(zhì)量性狀出現(xiàn)變異的以多數(shù)個體表現(xiàn)的性狀為準。于2019年3月觀察孕蕾期2年生枝條主干的顏色，定義莖干顏色為綠色和紅色；統(tǒng)計2年生枝條主干離地40～55 cm處皮刺數(shù)量(N)，定義皮刺密度為密集(N≥30)、中等(30>N≥15)、稀疏(N<15)3個級別；定義葉形為7裂葉、5裂葉2種；根據(jù)果期幼葉尖端是否為紅色，定義幼葉色苷類型為有、無 2種；定義花瓣基部至外緣頂端的距離為花瓣長；定義連接枝干和果實之間的果柄的距離為果柄長；根據(jù)果實頂端型態(tài)，定義果型為漸尖、截平2種類型；定義藥材采收期，即綠轉(zhuǎn)黃期果實的干質(zhì)量為果質(zhì)量。

2.2 ISSR標記擴增

每份樣品隨機選取嫩葉10片，采用十六烷三甲基溴化胺(CTAB)法提取樣品材料中的基因組DNA，用1×TE緩沖液調(diào)整其質(zhì)量濃度為100 ng·μL-1。擴增反應體系為基因組DNA模板1 μL(約100 ng)、引物1 μL(10 μmol·L-1)、MgCl2溶液(25 mmol·L-1)1 μL、Mix-Taq10 μL和ddH2O 7 μL，總體積為20 μL。擴增程序為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。以24份樣品等量混樣提取的總DNA為模板，采用ISSR引物進行多態(tài)性篩選。ISSR標記引物為加拿大哥倫比亞大學公布的引物。以ISSR引物分別擴增PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物在含有染料的2%瓊脂糖凝膠中電泳后用成像儀拍照，引物序列見表2。

表2 ISSR標記及其擴增結(jié)果

2.3 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 16.0軟件，將表觀性狀數(shù)標準化處理后進行相關性分析和聚類分析；應用POPGENE 1.32軟件對ISSR條帶數(shù)據(jù)的遺傳多樣性進行分析；應用NTSYS-pc 2.10軟件基于UPGMA方法，構(gòu)建聚類樹狀圖。

3 結(jié)果

3.1 掌葉覆盆子表型特征分析

24份掌葉覆盆子資源來源覆蓋覆盆子的主產(chǎn)區(qū)。結(jié)果表明，掌葉覆盆子表型豐富，8個表觀性狀包括5個質(zhì)量性狀和3個數(shù)量性狀。掌葉覆盆子的藥材采收期為處于青色轉(zhuǎn)黃時期的未成熟果實[16]，記錄藥材采收期的果干質(zhì)量。相關性分析表明，花瓣長度和產(chǎn)量性狀果質(zhì)量有正相關關系，其他性狀之間沒有顯著的相關性(表3)。由于花瓣長和果質(zhì)量性狀間有相關關系，且果質(zhì)量為果實快速發(fā)育期性狀，因此，基于表型性狀的聚類分析，選用了莖干顏色、皮刺密度、葉形、幼葉色苷、花瓣長、果柄長、果型7個性狀。聚類結(jié)果顯示，上述7個表觀性狀可以較好地區(qū)分和描述華東地區(qū)的掌葉覆盆子資源(圖1)。同時，基于7個表觀特征數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果分析，表型特征與地域分布無關。對比分子數(shù)據(jù)聚類結(jié)果沒有呈現(xiàn)出顯著的區(qū)域間表型分化。

圖1 基于表型數(shù)據(jù)的掌葉覆盆子聚類分析圖

表3 掌葉覆盆子表型性狀間相關性

3.2 ISSR標記擴增產(chǎn)物多態(tài)性分析

應用8條擴增譜帶清晰并呈多態(tài)性的ISSR引物(圖2)對29份材料進行擴增，對24份掌葉覆盆子資源的標記多態(tài)性進行統(tǒng)計，共檢測到90個位點。其中，多態(tài)性位點58個，占比64.44%(表2)。

注：M.DNA Maker；1～24.掌葉覆盆子樣品的帶型；25～29.山莓、茅莓、三花懸鉤子、紅樹莓和盾葉莓樣品的帶型。

3.3 遺傳距離和聚類分析

本研究中，掌葉覆盆子種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為遺傳相似系數(shù)為0.536 6～0.878 0，平均值為0.715 7。其中，遂昌和南屏的材料遺傳相似性系數(shù)最低，為0.536 6；臨岐和建德的材料遺傳相似性最高，為0.878 0。該結(jié)果表明，本研究中掌葉覆盆子材料的整體遺傳相似性較大，來自不同地域的材料也存在較大的差異。應用NTSYS-pc軟件分析供試材料間的遺傳相似系數(shù)，基于UPGMA方法，構(gòu)建聚類樹狀圖(圖3)。本研究的公示材料均為ISSR標記信息，可以明確區(qū)分掌葉覆盆子與近緣懸鉤子植物，懸鉤子屬(Rubus)空心莓組(Sect.Idaeobatus)植物，山莓和三花懸鉤子與掌葉覆盆子均為單葉，且花著生于小枝頂部，屬于球果亞組(Subsect.Corchorifolii)，聚類的親緣關系較近；紅樹莓和茅莓均為復葉，分屬于絨毛葉亞組(Subsect.Stimulantes)和傘房花序亞組(Subsect.Idaeanthi)，兩者遺傳距離較近；而盾葉莓屬于盾葉亞組(Subsect.Peltati)，為單生葉，聚類于茅莓與球果亞組植物之間。在相似系數(shù)為0.67～0.70處24份掌葉覆盆子資源又可進一步聚為浙北、浙南和閩北3組，說明不同地域的掌葉覆盆子出現(xiàn)了一定的遺傳分化。以浙北、浙南和閩北為群體，應用POPGEN軟件，進一步分析可知區(qū)域間群體的遺傳距離<0.253 8、遺傳一致度>0.775 9、基因分化系數(shù)(Gst)為0.320 3、基因流(Nm)為1.061 2，說明3個區(qū)域群體間的遺傳分化不明顯。

圖3 基于ISSR標記信息的掌葉覆盆子與近緣植物聚類分析圖

3.4 遺傳多樣性分析

在物種水平上，掌葉覆盆子的基因多樣性指數(shù)(H)=0.272 0、Shannon′s信息指數(shù)(I)=0.412 7(表4)，說明該物種的基因遺傳多樣性較高。浙南地區(qū)的掌葉覆盆子H高于浙北地區(qū)，而I低于浙北區(qū)域。該結(jié)果可解釋為浙北地區(qū)每份資源平均的基因多樣性較高，而浙南地區(qū)不同材料間的有效等位基因數(shù)差異較大。閩北地區(qū)的供試的材料數(shù)量較少，導致H和I較低，不能顯示區(qū)域內(nèi)物種的遺傳多樣性，需要加大樣本做進一步研究。

表4 基于ISSR標記信息的掌葉覆盆子遺傳多樣性參數(shù)

4 討論

4.1 藥用覆盆子的種源引種與選育

從物種基原的水平上分析，中藥材覆盆子基原植物呈現(xiàn)逐漸純化的過程。傳統(tǒng)中藥材覆盆子來源豐富，歷史上諸多薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物的果實被當作“覆盆子”入藥，傳統(tǒng)醫(yī)藥書籍中記載的覆盆子基原植物名稱有“蓬藟”“插田泡”“茅莓”“覆盆子”“黃果懸鉤子”“寒莓”等，隨時間推移，醫(yī)家逐漸明確“覆盆子”為植物掌葉覆盆子的未成熟干燥果實[17]。目前，《中華人民共和國藥典》2020年版收錄的覆盆子的基原植物也只有掌葉覆盆子[3]。本研究的全基因組的分子標記研究表明，掌葉覆盆子與近緣的懸鉤子屬植物有明顯的物種分化。與此同時，掌葉覆盆子相對于其他懸鉤子屬近緣植物的藥理效果系統(tǒng)評價還有待進一步研究。本研究基于ISSR標記信息對物種的區(qū)分與聚類結(jié)果與Yan等[18]基于葉綠體基因(rbcL、rpl20-rps12、trnG-trnS)和核基因(ITS、GBSSI-2、PEPC)的懸鉤子屬植物聚類結(jié)果是一致的，表明ISSR標記體系可以較好地區(qū)分懸鉤子屬近緣植物。目前，掌葉覆盆子已經(jīng)形成了一定的種植規(guī)模，其種植模式仍處于原地野生資源引種繁育階段，還沒有穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)藥用品種育成。綜上所述，掌葉覆盆子的ISSR標記基因多樣性較高、種質(zhì)區(qū)分性較好、研究效率高，可以運用于種質(zhì)區(qū)分和遺傳研究工作。

4.2 掌葉覆盆子的遺傳結(jié)構(gòu)與分化

掌葉覆盆子物種水平上H=0.272 0、I=0.412 7，高于瀕危植物五小葉槭[19]、稀有藥用植物滇重樓[20]、已經(jīng)馴化的植物黃瓜[21]，與華南廣布的華中五味子相當[22]，表現(xiàn)出中等偏高的遺傳多樣性。植物種群的遺傳多樣性變化與物種自身的繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因突變，以及外部環(huán)境變化、人類活動導致的種群隔離和生境片斷化、異地引種等諸多因素相關[23-24]。華東地區(qū)掌葉覆盆子整體呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，該結(jié)果與掌葉覆盆子為蟲媒花、生長年限久、可以依靠鳥類長距離傳播等生物特征相關。與此同時，聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.67～0.70處，供試樣品呈現(xiàn)出區(qū)域分化的現(xiàn)象，導致該現(xiàn)象的原因可能與不同緯度地區(qū)群體的花期不遇，生長區(qū)域因人為活動產(chǎn)生隔離等原因相關。雖然，掌葉覆盆子的野生群體具有較高的遺傳多樣性，但是在掌葉覆盆子的引種馴化過程中，往往采用根蘗芽無性繁殖，該操作導致基因多樣性的下降，進而加大病蟲害大規(guī)模爆發(fā)的風險[25-26]。因此，在發(fā)展掌葉覆盆子產(chǎn)業(yè)的同時，應注意保護野生掌葉覆盆子資源，同時注意引種資源的品種更新。