張 濤，李維麗，邱曉拂，劉百川，李高遠(yuǎn)，馮才鑫，廖俊發(fā)，林康健

1廣東省第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510317；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州510515

勃起功能障礙（ED）是臨床上最常見的男性性功能障礙疾病，其發(fā)病率高，預(yù)計(jì)2025年全球的ED患者將達(dá)3.20億［1-2］。陰莖勃起的血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)源于動(dòng)脈血流入的增加、陰莖海綿體平滑肌（CCSM)的舒張以及靜脈回流的減少，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的功能損害都會(huì)導(dǎo)致ED發(fā)生，而陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（CCSMCs）是構(gòu)成CCSM的基本單位，其在保障CCSM舒張和收縮生理功能中處于重要的核心地位［3］。CCSMCs分為收縮型和合成型兩種表型，在一定條件下收縮型和合成型可以相互轉(zhuǎn)化，由收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化稱為表型轉(zhuǎn)化，研究表明，CCSMCs表型轉(zhuǎn)化與ED的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但機(jī)制尚未完全明確［3-6］。

轉(zhuǎn)錄因子TEAD1也稱轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子（TEF-1），是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TEADs基因家族成員，在除血液細(xì)胞外所有組織細(xì)胞中豐富表達(dá)，其調(diào)控對(duì)于胚胎發(fā)育、心臟發(fā)生、肌細(xì)胞生成、血管損傷及細(xì)胞分化等至關(guān)重要的基因表達(dá)［7-8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)TEAD1能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖，并可使VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化［9-10］。但TEAD1與VSMCs相類似的CCSMCs，尤其是處于糖尿病狀態(tài)下的CCSMCs表型轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來新興的一種基因編輯技術(shù)，可將特定DNA基因序列敲除、插入或定點(diǎn)突變，具有高效、精準(zhǔn)、快捷、特異性高及操作方便簡單等特點(diǎn)［11-12］。本研究將利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)，敲除糖尿病性ED大鼠CCSMCs中TEAD1基因，探究敲除TEAD1基因后對(duì)糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

SPF級(jí)成年SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量180～210 g，交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)勃起功能正常，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（使用許可證號(hào)：SCXK粵2013-0002）。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、PBS緩沖液（Gibco）。鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma）。優(yōu)越型血糖儀及配套血糖試紙為美國羅氏產(chǎn)品。MP150 型多導(dǎo)電生理記錄儀（Biopac）。CRISPR/Cas9表達(dá)載體pLenti-U6-sgRNASFFV-Cas9-2A-Puro（愛必夢(mèng)生物）。TEAD1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、SMMHC、Calponin及β-actin抗體（Abcam）；PCNA 抗體（CST）。限制性內(nèi)切酶Bbs I（Thermo）。Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取質(zhì)粒DNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購和PCR試劑盒（TaKaRa）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖尿病性ED大鼠模型的建立 采用我們已報(bào)道的方法［4-5］，建立糖尿病ED大鼠模型。20只SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h。予以STZ處理組大鼠（n=15）一次性腹腔注射STZ（以PH=4.0的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制），劑量60 mg/kg，造模后恢復(fù)進(jìn)食。正常對(duì)照組（n=5）僅注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，測量各組大鼠隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，并伴有多飲、多食、多尿者為糖尿病動(dòng)物造模成功標(biāo)準(zhǔn)。造模8周后對(duì)正常對(duì)照組及糖尿病組模型大鼠進(jìn)行陰莖勃起功能測定，進(jìn)而篩選糖尿病性ED大鼠模型。即通過電刺激海綿體神經(jīng)使陰莖海綿體充血勃起，刺激參數(shù)：電壓5 V，頻率15 Hz，波寬5 ms，每次刺激持續(xù)60 s。使用Biopac MP150生理儀套裝連續(xù)監(jiān)測各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）及平均頸動(dòng)脈壓（MAP）。

1.2.2 大鼠CCSMCs 的原代培養(yǎng)及鑒定 采用改良組織塊法原代培養(yǎng)大鼠CCSMCs。斷頸處死大鼠，無菌條件下切開包皮，陰莖腳水平橫行切取陰莖，迅速移入含有雙抗的PBS緩沖液中，去除陰莖軟骨、尿道及背側(cè)血管等組織。PBS漂洗去血細(xì)胞后，將海綿體組織剪成0.5 mm×1 mm×1 mm小組織塊，按0.5 cm的間隔放置到涂有20%FBS 的25 mL 無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，使其固定。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使有組織小塊的一面向上，加2 mL已配制好的DMEM液，置入37 ℃、5%CO2、95%空氣培養(yǎng)箱，靜置5 h后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液與組織塊接觸。3 d后，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞從組織塊游出，次日去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，將各組細(xì)胞傳代至P2代后，行免疫熒光染色鑒定。

1.2.3 TEAD1基因CRISPR/Cas9打靶位點(diǎn)的選擇 從NCBI 中檢索大鼠TEAD1 基因序列（Accession No：NM_001198589.1），將序列輸入在線軟件CRISPR Design（http://crispr.mit.edu/）并設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠TEAD1基因的sgRNA，在靶序列正義鏈的5'端添加-CACCG，反義鏈的5'端添加AAAC，3'端添加C。靶位點(diǎn)和合成的oligo DNA序列見表1。

表1 DNA寡核苷酸序列Tab.1 DNAoligo sequence

1.2.4 gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 使用Bbs I限制性內(nèi)切酶將CRISPR/Cas9 表達(dá)載體pLenti-U6-sgRNA-SFFVCas9-2A-Puro切割為線性載體，sgRNA oligo DNA 單鏈退火后形成雙鏈，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，4 min；72 ℃，2 min；37 ℃，2 min；25 ℃，2 min；4 ℃，1 min。雙鏈DNA經(jīng)T4連接酶插入表達(dá)載體U6啟動(dòng)子下游。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑選平板上的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，挑取陽性克隆測序。保種含有正確序列的菌液，提取質(zhì)粒備用。

1.2.5 慢病毒包裝與滴度測定 將表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒2nd Generation Packaging System Mix加入1 mL無血清培養(yǎng)基中，Lentifectin轉(zhuǎn)染試劑稀釋到上述培養(yǎng)基中，混勻，制備DNA/LentiFectin慢病毒混合物，室溫孵育20 min。將包裝細(xì)胞293T中培養(yǎng)基吸掉，加入DNA/LentiFectin復(fù)合物，轉(zhuǎn)染48 h后收集培養(yǎng)基，進(jìn)行病毒液濃縮純化，采用熒光定量PCR法測定病毒滴度。

1.2.6 慢病毒感染糖尿病性ED大鼠CCSMCs及篩選穩(wěn)定細(xì)胞株 原代培養(yǎng)的P2～3代糖尿病ED大鼠CCSMCs用于實(shí)驗(yàn)。感染前24 h，取無菌潔凈的6孔板，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化重懸，按1×105/mL密度接種，取1 mL接種于6 孔板，加入感染增強(qiáng)液Polybrene，工作濃度4 μg/mL。鋪板后參照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最適感染復(fù)數(shù)（MOI）加入慢病毒顆粒進(jìn)行感染。感染24 h后，用新鮮完全陪養(yǎng)基更換感染培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，換含有1 μg/μL 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞做擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 Western blot檢測TEAD1基因敲除效率 收集細(xì)胞，用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，制備蛋白樣品，BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉室溫封閉，加入一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，TBST洗液洗滌，與ECL試劑反應(yīng)、曝光，分析灰度值。實(shí)驗(yàn)分組：TEAD1-sgRNA慢病毒感染的糖尿病ED大鼠CCSMCs為實(shí)驗(yàn)組（sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3）、空載體病毒感染的糖尿病ED大鼠CCSMCs為陰性對(duì)照組（CCSMCs-NC）、不感染病毒的糖尿病ED 大鼠CCSMCs作為空白對(duì)照組（CCSMCs-CK）。

1.2.8 qRT-PCR檢測平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物平滑肌肌球蛋白重鏈（SMMHC）、堿性調(diào)寧蛋白（Calponin）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）mRNA的表達(dá)情況 所有引物均由華大基因設(shè)計(jì)和合成，目的基因引物序列見表2。實(shí)驗(yàn)分3 組：敲除TEAD1 基因的糖尿病性ED 大鼠CCSMCs為實(shí)驗(yàn)組（CCSMCs-sgRNA-2）、空載體病毒感染的糖尿病ED 大鼠CCSMCs 為陰性對(duì)照組（CCSMCs-sgRNA-NC）、不感染病毒的糖尿病ED大鼠CCSMCs作為空白對(duì)照組（CCSMCs-CK）。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，參照說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，進(jìn)行qRT-PCR，對(duì)SMMHC、Calponin和PCNA 的表達(dá)進(jìn)行分析，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參，2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 目的基因引物序列Tab.2 Target gene primer sequence

1.2.9 Western blot 檢測SMMHC、Calponin和PCNA的蛋白水平表達(dá)情況 本部分實(shí)驗(yàn)分組同qRT-PCR部分，即分3 組：實(shí)驗(yàn)組CCSMCs-sgRNA-2、陰性對(duì)照組CCSMCs-sgRNA-NC和空白對(duì)照組CCSMCs-CK。分別收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，制備蛋白樣品，BCA法進(jìn)行蛋白定量，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉室溫封閉，分別加入SMMHC、Calponin和PCNA一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，TBST洗液洗滌，與ECL試劑反應(yīng)、曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立糖尿病性ED大鼠模型

STZ處理組有1只大鼠在飼養(yǎng)過程中死亡，最終成糖尿病大鼠及糖尿病性ED 大鼠模型分別為6 只和8只。正常對(duì)照組（NDM）、糖尿病組（DM）、糖尿病性ED組（DM&ED）大鼠ICP/MAP比值分別為：0.62±0.07、0.58±0.04 和0.30±0.05，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=70.474，P<0.001），且ICP/MAP比值在糖尿病性ED組大鼠明顯低于正常對(duì)照組和糖尿病組（均為P<0.001），而其在正常對(duì)照組和糖尿病組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.599，表3）。

2.2 CCSMCs生長情況及鑒定結(jié)果

表3 各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）、平均動(dòng)脈壓（MAP）和ICP/MAP測定結(jié)果Tab.3 Intracorporal pressure(ICP),mean arterial pressure(MAP)and ICP/MAP ratio measured in each group(Mean±SD)

在細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)過程中，1份正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)樣本因細(xì)菌污染而剔除。與正常對(duì)照組相比，糖尿病性ED組大鼠CCSMCs在形態(tài)上無明顯差別，表現(xiàn)多樣，可為梭形、菱形或星形等，其中較多為梭形細(xì)胞，呈平滑肌細(xì)胞特征性“谷-峰”樣生長。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞α-SMA 陽性細(xì)胞率達(dá)95%及以上，提示本實(shí)驗(yàn)通過原代取材所獲得細(xì)胞純度高，絕大部分為CCSMCs（圖1）。

圖1 陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞生長情況及鑒定結(jié)果Fig.1 Growth and identification of corpus cavemosum smooth muscle cells(CCSMCs)from rats.A:Passage-2 CCSMCs from normal control rat(Phase contrast microscope,original magnification:×100);B:Passage-2 CCSMCs from a diabetic rat with ED(×100);C:Passage-2 CCSMCs positive for α-SMA(immunofluorescence,×200).

2.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的鑒定

菌落PCR挑選出的陽性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA。隨機(jī)選取的陽性克隆經(jīng)測序鑒定表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 TEAD1基因敲除效果鑒定

包裝重組慢病毒并感染糖尿病ED大鼠CCSMCs，篩選后得到穩(wěn)定TEAD1 基因敲除細(xì)胞克隆，利用Western blot檢測各組TEAD1蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證敲除效率。如圖2所示，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及CCSMCs-sgRNA-1 組相比，CSMCs-sgRNA-2 組和CCSMCs-sgRNA-3 組TEAD1 蛋白水平顯著降低（P<0.002）；與CCSMCs-sgRNA-3組相比，CCSMCs-sgRNA-2組TEAD1蛋白水平有顯著差異（P=0.035），說明感染TEAD1-sgRNA-2的CCSMCs中的TEAD1蛋白水平最低，敲除效果最明顯，故以TEAD1-sgRNA-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 TEAD1基因敲除后對(duì)糖尿病ED大鼠CCSMCs表型標(biāo)志物mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響

利用TEAD1-sgRNA-2 慢病毒感染糖尿病性ED大鼠CCSMCs，采用qRT-PCR 和Western blot 檢測敲除TEAD1 基因?qū)Ρ硇蜆?biāo)志物SMMHC、Calponin 及PCNA mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CCSMCs-CK 組及CCSMCs-sgRNA-NC 組比較，SMMHC 和Calponin 的mRNA 和蛋白水平表達(dá)在CCSMCs-sgRNA-2組中均顯著升高，PCNA的mRNA和蛋白水平表達(dá)在CCSMCs-sgRNA-2組中顯著下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）；而SMMHC、Calponin 及PCNA 的mRNA 和蛋白水平表達(dá)在CCSMCs-CK組及CCSMCs-sgRNA-NC組中均無差異（P均>0.05）。說明敲除TEAD1基因可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化（圖3）。

圖2 Western blot檢測敲除細(xì)胞系中TEAD1的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Expression of TEAD1 protein in CCSMCs from diabetic ED rat after infection with lentivirus determined by Western blotting. A:Immunoblot photographs for TEAD1 in the CCSMCs of diabetic ED rats.B:TEAD1 and β-actin bands were subjected to densitometry on the Gel Pro version 6.0 software,the ratio of TEAD1 and β-actin in the CCSMCs of diabetic ED rats were plotted for quantification of the blots.All results are representative of three independent experiments.*P<0.01 vs CCSMCs-CK group or CCSMCs-sgRNA-NC group or CCSMCs-sgRNA-1 group;#P=0.035 vs CCSMCs-sgRNA-3 group.

3 討論

ED是指陰莖勃起硬度不足以插入陰道或維持時(shí)間不足以圓滿完成性交，且發(fā)生頻率超過50%。研究表明，糖尿病人群發(fā)生ED的概率大約是非糖尿病人群的3.5倍，且發(fā)病率高達(dá)75%［13］。本研究參照以前報(bào)道的方法使用STZ成功建立了糖尿病性大鼠模型［4,14］，但糖尿病模型的構(gòu)建成功并不代表同時(shí)ED模型的成功，故要將糖尿病性大鼠模型與糖尿病性ED大鼠模型加以區(qū)分。我們通過檢測各組大鼠ICP和MAP發(fā)現(xiàn)，糖尿病性ED組大鼠ICP/MAP比值明顯低于正常對(duì)照組和糖尿病性大鼠組，這與已報(bào)道的文獻(xiàn)一致［5,14-16］，表明本實(shí)驗(yàn)糖尿病性ED大鼠模型構(gòu)建成功。同時(shí)，我們采用改良組織塊法對(duì)各組大鼠CCSMCs進(jìn)行原代培養(yǎng)［17］，即在組織塊法原代培養(yǎng)第3或4天，平滑肌細(xì)胞從組織塊爬出，第5天開始會(huì)有成纖維細(xì)胞爬出，而本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞爬出第2天時(shí)就去除組織塊，盡量避免成纖維細(xì)胞的污染，從而獲得了高純度的CCSMCs。本實(shí)驗(yàn)α-SMA陽性細(xì)胞率達(dá)95%及以上，從而保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與可靠性。

圖3 TEAD1基因敲除對(duì)糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型標(biāo)志物的影響Fig.3 Effects of TEAD1 gene knockout on phenotypic markers in CCSMCs from diabetic ED rats.A:qRT-PCR for SMMHC,calponin and PCNA mRNA levels in CCSMCs from diabetic ED rats infected with lentivirus. B:Western blot analysis of the protein levels of SMMHC,calponin and PCNA.*P<0.05 vs CCSMCs-CK group or CCSMCs-sgRNANC group;#P>0.05 vs CCSMCs-CK group.

筆者及一些學(xué)者通過構(gòu)建不同類型的ED大鼠模型，如糖尿病性ED、高血壓性ED、動(dòng)脈性ED及神經(jīng)源性ED等后發(fā)現(xiàn)，CCSMCs表型轉(zhuǎn)化現(xiàn)象往往伴隨出現(xiàn)于上述各類ED的病理生理進(jìn)程中［3-6］。在研究過程中要判斷CCSMCs是否發(fā)生表型轉(zhuǎn)化或逆表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞表型標(biāo)志物的選擇相當(dāng)重要。平滑肌細(xì)胞不同表型分別表達(dá)一些不同的表型標(biāo)志物，當(dāng)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時(shí)，這些標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變。SMMHC是鑒定平滑肌細(xì)胞處于收縮型的最佳指標(biāo)之一，是收縮表型高度特異性的標(biāo)志［18-20］。Calponin是平滑肌組織的特有蛋白，作為調(diào)節(jié)蛋白，因其僅在收縮型平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)，故更具有分化表型特異性，也是收縮型標(biāo)志物［19,21］。PCNA是DNA聚合酶的輔助因子，在細(xì)胞增殖、核酸代謝等中起重要作用，被認(rèn)為是合成型平滑肌細(xì)胞的重要標(biāo)志物［5,22-24］。故本研究選取上述三種標(biāo)志物作為研究對(duì)象，若收縮型標(biāo)志物（SMMHC、Calponin）的表達(dá)下調(diào)或合成型標(biāo)志物（PCNA）表達(dá)上調(diào)，則提示平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，即表型轉(zhuǎn)化，反之則為逆表型轉(zhuǎn)化。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種在基因組水平上由RNA指導(dǎo)Cas9蛋白選擇性編輯目的基因的方法，具有高效率、高特異性、高精準(zhǔn)度等特點(diǎn)，由于操作簡單、耗時(shí)少，目前應(yīng)用日益廣泛，其在疾病的基因編輯治療、基因敲除及調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用［11-12,25-28］。本研究以TEAD1 基因作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)了3 個(gè)不同的sgRNA序列，成功包裝了含有TEAD1-sgRNA的重組慢病毒，同時(shí)篩選得到了穩(wěn)定低表達(dá)TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs細(xì)胞系。通過Western Blot證實(shí)，感染TEAD1-sgRNA-2的CCSMCs中的TEAD1蛋白表達(dá)水平最低，敲除效果最明顯，可用于進(jìn)一步研究TEAD1功能。

TEAD1作為TEADs 家族最重要成員，持續(xù)表達(dá)在心肌和骨骼肌，可以調(diào)節(jié)心肌肌鈣蛋白C和肌球蛋白α和β重鏈基因以及血管平滑肌中α-SMA的表達(dá)，是肌肉發(fā)育中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子［7,9,29］。早在上世紀(jì)末就已發(fā)現(xiàn)敲除TEAD1會(huì)引起小鼠胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)心腔擴(kuò)大，骨小梁數(shù)量減少等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致小鼠胚胎在發(fā)育約12 d后死亡［30］。Liu等［19］在研究中證實(shí)，TEAD1可通過負(fù)性調(diào)控心肌素myocardin而抑制平滑肌細(xì)胞特異性基因SMMHC，α-SMA和calponin等的表達(dá)，同時(shí)破壞myocardin與血清應(yīng)答因子SRF復(fù)合物的形成，證明TEAD1能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。本研究我們利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，敲除糖尿病性ED大鼠CCSMCs中TEAD1，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，TEAD1基因敲除組收縮型標(biāo)志物SMMHC和Calponin mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào)，而合成型標(biāo)志物PCNA mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯減少，說明敲除TEAD1基因可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化，即逆表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的TEAD1基因敲除可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化。本研究成功構(gòu)建了定向敲除TEAD1基因的慢病毒載體，為進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，闡明TEAD1基因在糖尿病性ED發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。