王 卉，陳學(xué)平，陳 運(yùn)，曹穎詩(shī)，陳 瑤，劉國(guó)炳，黃莉萍

1南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州510515

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，其中，上皮性卵巢癌（EOC）是卵巢癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，發(fā)病率占85%以上［1］。卵巢癌發(fā)病早期臨床癥狀不明顯，確診時(shí)多為晚期［2］。早期卵巢癌患者的5年生存率可達(dá)92%，而晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為29%［3］。因此，卵巢癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)于提高患者的生存預(yù)后至關(guān)重要。ENTPD5作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶，可將UDP水解為UMP［4］，促進(jìn)蛋白質(zhì)的糖基化以及糖蛋白的折疊，其高表達(dá)可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移［5］。ENTPD5參與多種細(xì)胞功能過(guò)程，在宮頸癌、乳腺癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌以及前列腺癌等腫瘤中均表達(dá)增高［6-8］。但目前尚未見(jiàn)ENTPD5在卵巢癌中的相關(guān)研究報(bào)道，ENTPD5 是否在卵巢癌組織中呈高表達(dá)？ENTPD5是否可以成為卵巢癌早期診斷的新靶點(diǎn)？這些問(wèn)題值得我們進(jìn)一步研究探討。

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)整合了全球最大的癌基因芯片信息和數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，可以較為全面的挖掘常見(jiàn)癌癥亞型和正常組織差異基因的表達(dá)［9］。本研究通過(guò)收集以O(shè)ncomine為主的多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，挖掘ENTPD5在上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況，并分析ENTPD5在上皮性卵巢癌中的可能作用途徑及其與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，為后續(xù)ENTPD5基因與上皮性卵巢癌的相關(guān)性研究提供證據(jù)支持。

1 資料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 生物信息學(xué)分析資料 通過(guò)Oncomine及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析ENTPD5在上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達(dá)情況和生存意義；通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因表達(dá)水平與患者年齡、種族及分期、分級(jí)的相關(guān)性；采用GSEA富集分析軟件分析基因在上皮性卵巢癌中可能作用機(jī)制；CIBERSORT包分析ENTPD5與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。

1.1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件為：（1）Cancer Type：Ovarian cancer；（2）Gene：ENTPD5；（3）Data Type：mRNA；（4）臨界值設(shè)定條件（Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top10%），采用箱式圖描述結(jié)果。

1.1.3 TCGA 網(wǎng)站下載上皮性卵巢癌相關(guān)數(shù)據(jù)，使用“surivial”包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析。

1.1.4 UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索目錄，檢索條件為：（1）Cancer Type：Epithelial ovarian cancer；（2）Gene：ENTPD5。

1.1.5 從TCGA下載379例上皮性卵巢癌患者相關(guān)表達(dá)數(shù)據(jù)，整理后導(dǎo)入GSEA軟件，參照由GSEA網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)提供與生物信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因集，按照省缺加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)法，重復(fù)分析1000次。GSEA分析結(jié)果包括3個(gè)關(guān)鍵統(tǒng)計(jì)量，分別為標(biāo)準(zhǔn)化富集得分（NES），錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率得分（FDR q-val）和p-val 值。（NES>1 為標(biāo)準(zhǔn)富集，F(xiàn)DR q-val越小表明富集越明顯，p-val<0.05表明存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

1.1.6 Bioconductor 網(wǎng)站下載CIBERSOR 包對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)上皮性卵巢癌數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 一般資料 為驗(yàn)證Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)ENTPD5基因芯片結(jié)果，收集2018年7月～2019 年7月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院行手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者23例，獲取癌巢標(biāo)本23份，同期獲取正常卵巢標(biāo)本15份作為對(duì)照（因?qū)m頸癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病切除卵巢者，術(shù)后病理結(jié)果提示無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)）。手術(shù)標(biāo)本切下后，立即將新鮮組織進(jìn)行凍存。于病理科收集2017 年7 月～2019 年7月的石蠟標(biāo)本，其中上皮性卵巢癌組織50份，正常卵巢組織6份（因?qū)m頸癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病切除卵巢者，術(shù)后病理結(jié)果提示無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)）以進(jìn)行預(yù)后及臨床病例特征分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)術(shù)后病理確診為上皮性卵巢癌；（2）手術(shù)前未接受過(guò)放療、化療、靶向藥物治療及免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他部位惡行腫瘤伴有卵巢轉(zhuǎn)移；（2）合并自身免疫性疾病。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有的組織樣本采集過(guò)程均獲得患者本人同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 制劑 Trizol、RT-qPCR所用試劑；RIPA裂解緩沖液（ThermoFish）；抗ENTPD5抗體（Abcam）。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank 中人ENTPD5 mRNA序列，采用PrimerPremier3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成，以18 s為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 取上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織行蛋白提取、變性、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色，搖床上用5%的脫脂牛奶（0.5%TBST配），封閉1 h。稀釋一抗、二抗，加入混合好的ECL溶液充分反應(yīng)，1～2 min 后開(kāi)始曝光，曝光后的膠片用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影，根據(jù)不同的發(fā)光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。將膠片進(jìn)行掃描存檔，Photoshop整理去色，ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目的條帶的灰度值。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)方法按照商品使用說(shuō)明書(shū)，Trizol試劑從上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中分別提取總RNA，ND-1200核酸定量檢測(cè)儀（Thermo）測(cè)定總RNA濃度和吸光度值，以1.8≤吸光度值≤2.0為合格?？俁NA經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，18 S、28 S兩條區(qū)帶清晰可見(jiàn)，所有樣本所提取的總RNA 質(zhì)量合格。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix 商品使用說(shuō)明合成cDNA，使用SYBR?PremixExTaqTM10 μL 進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)在ABI7500 實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行，以18 s 為內(nèi)參，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase Free Water 8.4 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、34 s；共40個(gè)循環(huán)；60 ℃退火30 s。選擇18 s作為內(nèi)參，采用計(jì)算2-△△CT值方法進(jìn)行表達(dá)量相對(duì)定量分析。

1.2.6 免疫組化 將上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織進(jìn)行脫蠟、水化后，PBS洗滌，放入pH為6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，在微波爐中加熱10 min，再次PBS洗滌，在3%的雙氧水中浸泡10 min進(jìn)行淬滅以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，2%的牛血清蛋白液封閉30 min，加入ENTPD5單克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，加入通用型二抗室溫下孵育30 min，滴加DAB顯色后用蘇木精液體復(fù)染，濃度梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：每張病理切片至少用4個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，當(dāng)染色細(xì)胞數(shù)目小于或等于總細(xì)胞數(shù)目的5%時(shí)，判讀結(jié)果為ENTPD5陰性，當(dāng)染色細(xì)胞數(shù)目大于總細(xì)胞數(shù)目的5%時(shí)，判讀結(jié)果為陽(yáng)性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用配對(duì)樣本卡方檢驗(yàn)分析ENTPD5在上皮性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)差異，蛋白印跡結(jié)果采用ImageJ軟件作圖分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)手段挖掘結(jié)果

通過(guò)Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，正常卵巢組織中ENTPD5的表達(dá)顯著低于上皮性卵巢癌組織（P<0.05），且ENTPD5高表達(dá)時(shí)上皮性卵巢癌患者生存率顯著降低。由于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)所分析出來(lái)的生存曲線存在ENTPD5高表達(dá)與低表達(dá)曲線交叉現(xiàn)象，故使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)再次對(duì)其生存意義進(jìn)行評(píng)估，證實(shí)ENTPD5高表達(dá)時(shí)患者生存率顯著降低（圖1，P<0.05）。

圖1 ENTPD5在上皮性卵巢癌中表達(dá)升高并影響患者總生存期Fig.1 Expression levels of ENTPD5 is upregulated in epithelial ovarian cancer(EOC)and related with the overall survival of the patients.A:Box plots showing much higher expressions of ENTPD5 in clear cell adenocarcinoma and serous adenocarcinoma of the ovary than in normal ovarian tissues. B:Overall survival curves for EOC patients with low and high ENTPD5 expression based on Oncomine dataset.C:Overall survival curves for EOC patients with low and high ENTPD5 expression based on TCGAdataset.*P<0.05.

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)ENTPD5表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者年齡、種族、癌癥分期、分級(jí)的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ENTPD5表達(dá)水平與患者年齡相關(guān)（圖2，P<0.05）。

圖2 ENTPD5表達(dá)水平與臨床特性的關(guān)系Fig.2 Correlation analysis of ENTPD5 with clinical characteristics of patients with EOC.A-D:Correlation analysis of the ENTPD5 expression with race(A),age(B),clinical stages(C)and tumor grade(D)of patients with ovarian serous adenocarcinoma based on TCGAdataset.*P<0.05.

通過(guò)GSEA分析，發(fā)現(xiàn)在上皮性卵巢癌中ENTPD5在B、T細(xì)胞介導(dǎo)的信號(hào)通路，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MAPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、TOLL樣受體信號(hào)通路，以及基因轉(zhuǎn)錄、糖降解、腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等過(guò)程中高度富集（表2）。

通過(guò)CIBERSOR包分析，發(fā)現(xiàn)在上皮性卵巢癌中ENTPD5的表達(dá)量與腫瘤局部的嗜酸性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞及肥大細(xì)胞的含量呈顯著負(fù)相關(guān)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，P<0.05）。

表2 ENTPD5表達(dá)在上皮性卵巢癌患者基因表達(dá)圖譜的相關(guān)基因通路的富集分析Tab.2 Enrichment analysis of Entpd5 gene by GSEA

2.2 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)RT-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中ENTPD5的表達(dá)水平（2.592±0.339）顯著高于正常卵巢組織（1.00±0.123），結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.312，P<0.01，圖4A）；Western blot 提示上皮性卵巢癌組織中ENTPD5表達(dá)水平亦顯著增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.566，P<0.05，圖4B）。

圖3 ENTPD5表達(dá)與免疫細(xì)胞含量的相關(guān)性Fig.3 ENTPD5 expression is negatively correlated with the contents of NK cells(A),mast cells(B)and eosinophils(C).

圖4 RT-qPCR和Western blot檢測(cè)卵巢癌及正常組織中ENTPD5的表達(dá)水平Fig.4 Results of RT-qPCR (A) and Western blotting (B) showing higher ENTPD5 expressions in clinical samples of ovarian cancer than in normal ovarina tissues.*P<0.05,**P<0.01.

對(duì)收集的6例正常卵巢組織、50例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本行免疫組化染色分析結(jié)果顯示：ENTPD5在上皮性卵巢癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中的表達(dá)均顯著高于正常卵巢組織（圖5，P<0.05）。進(jìn)一步評(píng)估ENTPD5表達(dá)與上皮性卵巢癌關(guān)鍵臨床參數(shù)之間的相關(guān)性結(jié)果顯示，ENTPD5 的表達(dá)與上皮性卵巢癌組織浸潤(rùn)程度、CA125水平、臨床FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度無(wú)明顯相關(guān)，而與病人年齡有相關(guān)性，ENTPD5在年齡56歲以上的患者組織中表達(dá)顯著增高（表3）。

3 討論

雖然近年來(lái)卵巢癌的治療取得一些進(jìn)展［10］，但由于其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于腫瘤中晚期，甚至伴有局部或全身轉(zhuǎn)移，五年生存率低下［11-13］。尋找與卵巢癌發(fā)病相關(guān)的有效生物標(biāo)志物，提高卵巢癌的早期診斷，對(duì)改善其預(yù)后具有重要意義。

ENTPD5主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核苷酸水解酶，在其家族中唯一被描述為原癌蛋白成員，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)核苷酸的分解代謝［14］，通過(guò)PI3K信號(hào)通路的激活，以及Mut-p53與Sp1-ENTPD5啟動(dòng)子區(qū)相互作用兩條途徑過(guò)度表達(dá)后［15］，在多個(gè)層次參與細(xì)胞過(guò)程，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，ENTPD5表達(dá)的下調(diào)可以降低腫瘤細(xì)胞的存活能力［8］。Villar 等［16］在前列腺癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，ENTPD5 表達(dá)水平與前列腺病變程度呈正相關(guān)性。2016年P(guān)NAS研究報(bào)道，作為突變的腫瘤抑制基因p53的靶分子，ENTPD5可以被突變的p53調(diào)控以調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［17］。此外，在黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多項(xiàng)研究中亦發(fā)現(xiàn)ENTPD5呈高表達(dá)，提示ENTPD5可能參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［6-8］。

圖5 ENTPD5在上皮性卵巢癌及正常卵巢組織中表達(dá)的免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining showing ENTPD5 expression in epithelial ovarian cancer and normal ovarian tissues. A:Immunohistochemical staining showed ENTPD5 expression in epithelial ovarian cancer and normal ovary tissue (Original magnification:×100).B:Column chart showed higher ENTPD5 expression in epithelial ovarian cancer than normal ovarian tissues.*P<0.05,**P<0.01 vs normal tissue.

表3 ENTPD5的表達(dá)與卵巢癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.3 Association of ENTPD5 expression with clinicopathological characteristics of 50 patients

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)ENTPD5與卵巢癌相關(guān)性的研究報(bào)道，ENTPD5是否可以成為上皮性卵巢癌早期診斷的新靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究?；谏鲜鲅芯勘尘?，首先我們通過(guò)Oncomine及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)證明，ENTPD5在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織，與患者生存呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步使用GSEA軟件分析發(fā)現(xiàn)，ENTPD5參與B、T細(xì)胞介導(dǎo)的信號(hào)通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、WNT信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路以及糖降解等過(guò)程。其中，在糖代謝的異常以及II型糖尿病的發(fā)生過(guò)程中，機(jī)體長(zhǎng)期暴露于高水平的血糖環(huán)境，可引起Ras-MAPK和PI 3-K-mTOR途徑的激活，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和疾病進(jìn)展［18-19］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、免疫逃避、腫瘤耐藥及維持腫瘤細(xì)胞低分化程度的功能［20-23］。WNT/PCP信號(hào)的激活被證實(shí)可通過(guò)增強(qiáng)上皮性卵巢癌細(xì)胞的自我更新和持續(xù)遷移、侵襲能力［24-27］。以上結(jié)果表明，ENTPD5可能通過(guò)上述多條通路參與上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。分析ENTPD5 與上皮性卵巢癌免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，ENTPD5的表達(dá)與NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)。此類(lèi)細(xì)胞可通過(guò)裂解、分泌或結(jié)合腫瘤壞死因子，介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的選擇和分化，抑制腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處組織的增殖、遷移和定植［28-32］。由此猜測(cè)，ENTPD5 也可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞局部微環(huán)境的方式，參與上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)RT-qPCR、Western blot 及免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)ENTPD5在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)顯著增高。

綜上所述，我們通過(guò)使用生物信息學(xué)手段深入挖掘上皮性卵巢癌組織中ENTPD5表達(dá)信息以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的手段，證明ENTPD5在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)顯著增高，為ENTPD5成為上皮性卵巢癌早期診斷的新靶點(diǎn)提供了理論支持證據(jù)。相對(duì)于傳統(tǒng)的單個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本的研究，腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)具有樣本量大、可信度高的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)疾病的診治可提供有力的生物學(xué)依據(jù)，可為進(jìn)一步探索ENTPD5基因與上皮性卵巢癌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。