唐振寧，丁小云，秦少杰，張朝林

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤外三科，寧夏 銀川750004

近年來甲狀腺癌的發(fā)病在世界范圍內(nèi)增加明顯，甲狀腺乳頭狀癌（PTC）發(fā)病率的增長最為明顯［1-2］。雖然PTC作為一種惰性腫瘤的預(yù)后通常較好，但頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺、骨遠處器官轉(zhuǎn)移仍然是PTC預(yù)后不佳的標志，約有15%的患者存在局部侵犯和治療耐受［3］。了解并探索PTC發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制，對PTC尤其是高危PTC患者實施更為精準的治療是當前亟待解決的問題。膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(CTHRC1)最初主要表達于損傷血管的外膜成纖維細胞和平滑肌細胞，通過限制膠原基質(zhì)沉積和促進細胞遷移來促進血管重構(gòu)［4-5］。近期研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1在一些腫瘤的形成和發(fā)展過程中表達增加［6］。研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1參與到前列腺癌［7］、乳腺癌［8］、卵巢癌［9］、胃癌［10］以及肺癌［11］等多種實體腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成等過程，是提示預(yù)后不良的重要因子。

有研究使用基因探針發(fā)現(xiàn)CTHRC1的互補DNA（cDNA）在甲狀腺癌組織中表達高于對照正常癌組織［12］。本課題組前期研究通過免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CTHRC1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織和良性病變組織，提示CTHRC1對甲狀腺惡性轉(zhuǎn)化過程中可能具有生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1的高表達和腫瘤的惡性程度相關(guān)［13］。然而CTHRC1在甲狀腺癌中具體的分子作用及機制仍未見報道。本研究通過干擾甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1中CTHRC1的表達，觀察CTHRC1對甲狀腺癌細胞中增殖及凋亡的作用，并對機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），F(xiàn)BS、胰蛋白酶（Gibco），Trizol（Invitrogen），Lipofectamine3000（Thermofisher）；p-ERK1/2（8544s）抗體（Cell Signaling）；CTHRC1 抗體（ab85739）、c-Caspase-3 抗體（ab2302）、c-PARP-1（ab32064）抗體（Abcam）。CCK-8 試劑盒（Dojindo），Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒（BD）。人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1細胞株由南京采卓生物科技有限公司提供。根據(jù)CTHRC1mRNA 設(shè)計4 條小干擾RNA（siRNA）寡核苷酸，siRNA及陰性對照（si-NC），序列見表1。

表1 CTHRC1siRNA干擾序列Tab.1 Sequences of siRNAof CTHRC1 for cell transfection

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)融合度到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養(yǎng)基傳代。轉(zhuǎn)染前1 d 6孔培養(yǎng)板中接種細胞，使轉(zhuǎn)染時細胞密度在70%～80%，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。將篩選的CTHRC1干擾序列轉(zhuǎn)染TPC-1細胞作為干擾組（si-CTHRC1組），隨機陰性對照序列（si-NC）轉(zhuǎn)染的TPC-1細胞作為陰性組（si-NC組），以不做任何處理TPC-1細胞為空白組（WT組）。

1.3 CCK-8實驗

收集各組對數(shù)生長期細胞將細胞消化制成單細胞懸液，以2×104/孔的密度接種于96孔板，100μL/孔。分別于培養(yǎng)0、12、24、48 h時進行CCK-8實驗，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，測定450 nm處的吸光度A450nm值。實驗重復(fù)3次。

1.4 Annexin V/PI雙染

分別用胰酶消化各組細胞，制備成單細胞懸液，800 r/min離心5 min后棄去上清液，用PBS緩沖液沖洗2次，再以1000 r/min離心5 min，之后按照Annexin VFITC/PI 試劑盒說明書加入200μL結(jié)合緩沖液，重懸細胞，加入10μL PI溶液和5μLAnnexinⅤ，混勻后冰浴避光下室溫染色30 min，每管內(nèi)補足結(jié)合緩沖液至500μL后上流式細胞儀檢測。

1.5 Real-time PCR檢測

采用TRIzol 試劑提取RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq 說明書配置PCR 反應(yīng)體系，進行PCR擴增。CHTRC1上游引引物5'-AGTGGCTCACT TCGGCTAAA-3'，下游引物5'-CCACAGAAGAAGT GCGATGA-3'。內(nèi)參上游引物5'-TGGACTTCGAGC AAGAGATG-3'，下游引物5'-GAAGGAAGGCTGGA AGAGTG-3'。最后結(jié)果用△△CT 表示。每個樣本獨立重復(fù)實驗3次。

1.6 Western blot檢測

取轉(zhuǎn)染48 h后的TPC-1細胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4 ℃離心10 min后，收集上清，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測樣品蛋白濃度，根據(jù)樣品濃度確定上量，蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，95～100 ℃沸水浴變性5 min，加入至制備好的SDSPAGE凝膠（5%濃縮膠，10%分離膠）上樣孔中，25 μL/孔，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，至溴酚藍到達膠板下沿，結(jié)束后取出凝膠，4 ℃轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂奶 粉封閉PVDF 膜1 h，加稀釋好的一抗4 ℃過夜，TBST 洗膜后加二抗稀釋液，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4 次，5 min/次。滴加新鮮配制的ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選CTHRC1siRNA，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細胞后CHTRC1的mRNA和蛋白表達

設(shè)置4組針對CTHRC1基因的siRNA，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細胞48 h后，提取總RNART-qPCR檢測，相比于WT組、si-NC組，siRNA2組的CTHRC1mRNA含量明顯被抑制（P<0.01，圖1A）。使用siRNA轉(zhuǎn)染染TPC-1細胞48 h后，提取蛋白質(zhì)進行Western blot的檢測，結(jié)果顯示，siRNA2組的CTHRC1蛋白條帶相對灰度值最低，CTHRC1 蛋白表達水平被明顯抑制（P<0.01，圖1B）。Western blot 結(jié)果與RT-qPCR 一致，因此后續(xù)以siRNA2進行檢測實驗。

圖1 Real-time PCR和Western blot 檢測不同siRNA轉(zhuǎn)染后細胞中CTHRC1的mRNA和蛋白表達變化Fig.1 Expression of CTHRC1 at mRNA(A)and protein(B)levels in TPC-1 cells determined by real-time PCR and Western blotting after transfection with different CTHRC1 siRNA.***P<0.01 vs WT,###P<0.01 vs si-NC.

2.2 CTHRC1對TPC-1細胞增殖影響

干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細胞后，分別在0、1、2、3、4 d時檢測si-CTHRC1組、si-NC組和WT組在450 nm時的光密度值A(chǔ)450nm，繪制細胞增殖曲線。CCK8 檢測實驗結(jié)果顯示，與WT組和si-NC組相比，si-CTHRC1組A450nm值降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

圖2 下調(diào)CTHRC1表達對TPC-1細胞增殖的抑制作用Fig.2 Down-regulation of CTHRC1 suppresses the proliferation of TPC-1 cells.*P<0.05 vs si-NC.

2.3 CTHRC1對TPC-1細胞凋亡的影響

流式細胞儀分別檢測si-CTHRC1組、WT組和si-NC組的細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與WT組和si-NC組比較，si-CTHRC1組的細胞凋亡率明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖3）。

2.4 CTHRC1對TCP-1細胞中上凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot表明，si-CTHRC1組與WT組和si-NC組相比，凋亡相關(guān)蛋白c-caspase-3和c-PARP-1相對表達水平增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4）。

2.5 CTHRC1對TCP-1細胞中ERK通路的影響

Western blot實驗表明，與WT組和si-NC組相比，si-CTHRC1組p-ERK1/2表達水平增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

研究顯示CTHRC1在實體腫瘤的演進中作用重要作用，在宮頸癌組織中，CTHRC1過表達與腫瘤的分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)呈正相關(guān)［14-15］。也有研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1的高表達與結(jié)腸癌［16］、骨肉瘤［17］、乳腺癌［18］、食管癌［19］、胰腺癌［20］、卵巢癌［21］的預(yù)后不良相關(guān)。本研究團隊前期的研究顯示PTC細胞組織較正常組織高表達，且甲狀腺癌組織中CTHRC1的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)［13］。但對與CTHRC1在PTC發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子生物學(xué)作用尚未見相關(guān)報道。本研究首次通過siRNA 干擾TPC-1 細胞CHTRC1 的表達，通過干擾CTHRC1觀察TCP-1細胞增殖及凋亡情況的改變，結(jié)果顯示：通過siRNA 干擾TPC-1 細胞CTHRC1，TPC-1細胞增殖能力較對照組明顯減低。相同的結(jié)果在其他實體腫瘤中也有同樣發(fā)現(xiàn)［22］。有文獻報道干擾前列腺癌CTHRC1表達能夠抑制前列腺癌細胞的增殖和克隆形成［7］。同樣在乳腺癌［8］、肝癌［23-24］、食管癌［19］、骨肉瘤［25］、結(jié)腸癌［26］及腎癌［27］的研究中也證實了CTHRC1參與到腫瘤細胞的增殖過程中，CTHRC1能夠促進腫瘤細胞增殖。但在關(guān)于卵巢癌和宮頸癌的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)CTHRC1對腫瘤的增殖起作用［21,28］。因此包括本研究在內(nèi)多數(shù)研究表明CTHRC1能夠促進腫瘤細胞的增殖，但仍和腫瘤的具體類型相關(guān)。

圖3 下調(diào)CTHRC1表達CTHRC1后對TPC-1細胞凋亡促進作用Fig.3 Down-regulation of CTHRC1 promotes apoptosis of TPC-1 cells.

圖4 抑制CTHRC1對TPC-1細胞c-Caspase-3、c-PARP-1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of down-regulation of CTHRC1 expression on the expression of c-caspase-3 and c-PARP-1 in TCP-1 cells.*P<0.05 vs si-NC.

圖5 抑制CTHRC1對TPC-1細胞p-ERK1/2蛋白表達的影響Fig.5 Effect of down-regulation of CTHRC1 on expression of p-ERK1/2 in TCP-1 cells.*P<0.05 vs si-NC.

CTHRC1對腫瘤細胞凋亡作用的研究相對較少，有研究發(fā)現(xiàn)過表達CTHRC1能夠抑制乳腺癌的凋亡，CTHRC1能夠通過Bax/caspase-9/caspase-3調(diào)控乳腺癌細胞的凋亡過程［18］。也有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中，干擾CTHRC1后細胞凋亡比率增加，且c-caspase3和c-PRAP的表達增高［23］。而本研究干擾甲狀腺癌TPC-1細胞中CTHRC1的表達，采用流式細胞術(shù)AV/PI雙染檢測發(fā)現(xiàn)抑制CTHRC1 表達后PTC-1 細胞凋亡比率增加。Western bolt顯示c-caspase-3和c-PARP-1蛋白的表達增加。這一現(xiàn)象提示在甲狀腺乳頭狀癌TCP-1細胞中CTHRC1能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的凋亡。

CTHRC1對TPC-1細胞增殖與凋亡影響的信號通路尚未見相關(guān)報道。前期研究報道CTHRC1能夠通過Wnt/beta-catenin介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的增殖［29］。同樣在結(jié)腸癌中，CTHRC1能夠激活Wnt/PCP通路，促進增殖。作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs)通路的主要類型，ERK是調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的重要通路［30］。ERK通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用磷酸化活化，磷酸化的ERK1/2則會進入細胞核，作用于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為的作用［31］。研究報道在關(guān)節(jié)軟骨細胞中CTHRC1通過JNK1/2通路介到了IL-1β誘導(dǎo)的凋亡過程［32］，通過過表達CTHRC1，能夠通過MAPK/MEK/ERK通路促進食管鱗癌細胞增殖［19］。有研究也發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中，CTHRC1能夠活化ERK1/2介導(dǎo)腫瘤細胞侵襲［33］。目前多數(shù)研究認為ERK通路在甲狀腺癌尤其是PTC分子生物學(xué)過程中作用非常重要，是未來治療的重要靶點之一［34］。本研究顯示抑制CHTRC1 能夠抑制ERK1/2 通路的活化，提示了ERK通路可能參與了CHTRC1對TPC-1細胞增殖和凋亡過程。

綜上所述，本結(jié)果顯示CTHRC1能夠促進TPC-1的細胞的增殖、通過caspase-3、PARP-1抑制凋亡，這一機制可能通過ERK通路介導(dǎo)。我們將在今后通過體內(nèi)實驗研究進一步揭示CTHRC1對PTC的生長和轉(zhuǎn)移的影響及機制。