岳潤清，劉 璐，鐵雙貴，徐心志，陳娜娜

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

玉米是我國種植面積最大的糧食作物，不僅是重要的糧食來源，而且還是重要的飼料和工業(yè)原料，在我國國民經(jīng)濟中具有舉足輕重的地位[1-2]。玉米從播種到收獲過程中會發(fā)生各種蟲害，如亞洲玉米螟、黏蟲和地老虎等。在諸多害蟲中，亞洲玉米螟和歐洲玉米螟對玉米的破壞最強[3]。通常情況下，會造成春玉米減產(chǎn)10%以上，夏玉米減產(chǎn)嚴(yán)重時達到30%以上，甚至絕收[4]；另外，害蟲在咬食玉米后，可造成玉米籽粒缺損、霉粒，玉米品質(zhì)嚴(yán)重下降[5-6]，對我國玉米生產(chǎn)及養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，培育抗蟲玉米是解決該問題的重要手段[7]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)為控制玉米害蟲提供了新的途徑[8]。國外轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米研究起步早[9]，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米于1996年開始商業(yè)化種植[10]。相比國外，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米研究晚，尚未獲批商業(yè)化種植。目前，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的研究主要以能殺死并抑制鱗翅目昆蟲生長的Bt基因為主，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米不但能有效地防治害蟲，而且對環(huán)境、有益昆蟲及人畜等均無不良影響。在Bt基因中，以Cry1Ab基因應(yīng)用較多，其編碼的殺蟲蛋白殺死和抑制亞洲玉米螟效果較好[11-12]。針對Bt基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中，存在表達量低、表達的抗蟲蛋白不穩(wěn)定、抗蟲效果不理想等問題，生物技術(shù)育種課題組對Bt基因Cry1Ab的原始序列進行了改造設(shè)計，克隆獲得了高效表達的Cry1Ab-Ma基因和殺蟲效果增強的Cry1Ab-t蛋白[13-14]，并根據(jù)植物基因的密碼子偏好性和基因表達蛋白的空間結(jié)構(gòu)對原始抗蟲基因Cry1Ab進行優(yōu)化改造[15]，利用原核表達系統(tǒng)誘導(dǎo)的蛋白進行室內(nèi)玉米螟喂食試驗，獲得了具有殺蟲效果的Cry1Ab-t基因。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上將設(shè)計改造優(yōu)化并具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲基因Cry1Ab-t克隆至帶有組成型表達啟動子(CaMV 35S啟動子)的植物表達載體pCAMBIA33000m中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化玉米幼胚，并采用亞洲玉米螟對轉(zhuǎn)基因玉米進行抗蟲性鑒定，為培育優(yōu)良的抗蟲玉米自交系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因受體玉米材料HiII由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供，取開花后12～14 d的玉米幼胚用于遺傳轉(zhuǎn)化。

含有人工改造合成的Cry1Ab-t基因(專利號：ZL 201010552618.0)的重組質(zhì)粒pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t、農(nóng)桿菌菌株EHA105、大腸桿菌DH5α均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。Bt-Cry1Ab/1Ac免疫試紙條(STX 06200/0050)產(chǎn)自于美國Agdia公司。各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自TaKaRa公司。其他藥品、試劑均為分析純，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。所用引物均由上海生工有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化 通過凍融法將重組質(zhì)粒pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株中，玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化參照劉允軍[16]的方法。將轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含1.5 mg/L雙丙氨磷的篩選培養(yǎng)基上(D培養(yǎng)基)進行第一輪篩選，然后將篩選到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含3.0 mg/L雙丙氨磷的篩選培養(yǎng)基上進行2輪篩選，最后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進行植株分化再生，待再生苗長至4～5 cm時，移栽至溫室。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 植物DNA提取按照Saghai-Maroof等[17]的改良后的CTAB方法進行，以轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米葉片的全基因組DNA為模板，采用Cry1Ab-t基因特異引物(F:5′-TGACGCTGACTGTGCTCGAT-3′；R:5′-AGGGGGAA CGTGAACTCAGG-3′)和Bar基因特異引物(F:5′-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3′；R:5′-TCGGTGA CGGGCAGGACCGG-3′)對經(jīng)過雙丙氨磷篩選的T0轉(zhuǎn)基因玉米進行檢測。Cry1Ab-t基因預(yù)期擴增片段大小為304 bp；抗除草劑Bar基因預(yù)期擴增片段大小為552 bp。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株目的基因的表達 轉(zhuǎn)基因玉米YA108 RNA提取以及RT-PCR檢測：待轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因玉米生長到5～6葉期，取0.1 g新鮮玉米葉片，液氮充分研磨后利用TRIzol (Invitrogen，美國)提取轉(zhuǎn)基因玉米YA108和非轉(zhuǎn)基因玉米葉片的總RNA，以O(shè)ligo(dT) 為引物(北京天根生化科技有限公司)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國)進行cDNA的合成，再以cDNA為模板，擴增Cry1Ab-t、Bar基因和內(nèi)參基因(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)GAPDH(F:5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′，R:5′-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3′；擴增片段長度為788 bp)。按照1.2.2基因組DNA的PCR檢測方法進行擴增。

轉(zhuǎn)基因材料YA108目的基因特異蛋白的檢測：取0.1 g新鮮玉米葉片，液氮充分研磨后，加600 μL緩沖液混勻，將蛋白質(zhì)檢測試紙條按照箭頭方向插入檢測樣品中，靜止5 min后觀察試紙條。最上面是質(zhì)控線，下面為目的基因表達蛋白的檢測線。

Cry1Ab-t蛋白含量檢測：利用美國Agdia公司生產(chǎn)的Bt Cry1Ab/Ac ELISA檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米中Cry1Ab-t蛋白的含量。取轉(zhuǎn)基因材料YA108不同組織樣品(葉片、莖、花粉、花絲、苞葉和籽粒)，每個組織取5株，液氮研磨，稱量0.1 g磨好的樣品加入1 mL樣品提取緩沖液。測量過程按說明書進行操作和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品的吸光度值均由酶標(biāo)儀(Biotek Synergy H1)讀取。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲性鑒定 試驗所用亞洲玉米螟為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，植物材料為轉(zhuǎn)基因玉米YA108及非轉(zhuǎn)基因玉米。室內(nèi)試驗采集吐絲期苞葉內(nèi)部花絲進行飼喂。大田試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，待玉米生長到7～8葉期時，以每株40～60頭玉米螟初孵幼蟲接于新葉上，3 d后重復(fù)接蟲1次，以非轉(zhuǎn)基因玉米為對照，心葉期接蟲14 d后調(diào)查食葉級別，采用 9 級標(biāo)準(zhǔn)[18]，并根據(jù)食葉級別確定心葉期抗螟性。玉米吐絲期接蟲方法同上，接蟲部位為花絲。轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因抗蟲玉米及非轉(zhuǎn)基因玉米葉片、花絲、莖稈及果穗玉米螟抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因玉米植株的獲得

將重組表達載體pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105，取授粉后的玉米幼穗進行剝胚，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法進行玉米幼胚的轉(zhuǎn)化。共培養(yǎng)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上，得到抗性愈傷組織，然后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基，經(jīng)過分化得到玉米再生植株，再生植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，最后進行再生植株的煉苗和移栽(圖1-A-F)，共獲得116株具有雙丙氨磷抗性的T0轉(zhuǎn)基因玉米再生植株。

2.2 轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因玉米植株中外源基因的PCR檢測

為了檢測再生玉米植株基因組中是否有目的基因Cry1Ab-t和標(biāo)記基因Bar，依據(jù)目的基因Cry1Ab-t和標(biāo)記基因Bar特異引物進行PCR擴增檢測，116株抗性再生植株中有82株可以擴增出與目的基因Cry1Ab-t(304 bp)和標(biāo)記基因Bar(545 bp)大小一致的目的片段，而非轉(zhuǎn)基因玉米和空白對照沒有擴增出特異目標(biāo)條帶，可以初步證明，目的基因Cry1Ab-t已經(jīng)整合到陽性轉(zhuǎn)基因玉米植株基因組中，部分目的基因Cry1Ab-t和標(biāo)記基因Bar的PCR檢測結(jié)果見圖2，3。從陽性轉(zhuǎn)基因植株中挑選長勢良好、能結(jié)實的YA108用于下一步目標(biāo)基因蛋白表達和抗蟲鑒定試驗。

2.3 轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因玉米植株中外源基因的表達檢測

RT-PCR分析結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因玉米YA108中，目的基因Cry1Ab-t和篩選標(biāo)記基因Bar在RNA水平上表達穩(wěn)定，而在非轉(zhuǎn)基因玉米中未檢測到表達(圖4)。結(jié)果證明，外源抗蟲基因Cry1Ab-t和篩選標(biāo)記基因Bar已整合到玉米基因組中并穩(wěn)定表達。

采用試紙條對轉(zhuǎn)基因玉米YA108進行特異目的蛋白Cry1Ab-t和Bar進行檢測，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米YA108 抗蟲蛋白Cry1Ab-t和Bar蛋白試紙條均出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測線2條帶(部分試紙條檢測結(jié)果見圖5)。質(zhì)控線出現(xiàn)證明結(jié)果可信；檢測線的深淺與玉米中Cry1Ab-t和Bar蛋白表達的強弱呈正比。從檢測結(jié)果可以看出，篩選標(biāo)記蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米YA108中得到表達，抗蟲目的蛋白Cry1Ab-t在轉(zhuǎn)基因玉米YA108中高效表達。

由圖6可知，轉(zhuǎn)基因玉米YA108在所測組織中均能檢測到Cry1Ab-t蛋白，葉片中Cry1Ab-t蛋白含量最高，為27.30 μg/g；其次為苞葉，為17.98 μg/g；花絲和莖稈中Cry1Ab-t蛋白含量較低，分別為12.10,12.64 μg/g；Cry1Ab-t蛋白在花粉中含量最低，蛋白含量僅為0.93 μg/g；成熟后水分含量低于15%玉米籽粒中Cry1Ab-t蛋白含量為15.56 μg/g。表明轉(zhuǎn)基因材料YA108各個組織部位均有Cry1Ab-t蛋白表達，可以保證轉(zhuǎn)基因玉米在整個生長期免受靶標(biāo)害蟲危害，提高轉(zhuǎn)基因玉米材料的產(chǎn)量。經(jīng)多重比較分析發(fā)現(xiàn)，莖稈、花絲和雄穗中Cry1Ab-t蛋白含量無顯著差異，而根、莖稈、花粉、葉片中Cry1Ab-t蛋白含量差異顯著，根、苞葉和種子中Cry1Ab-t蛋白含量無顯著差異。

2.4 轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因玉米株系抗蟲性鑒定

葉片危害調(diào)查結(jié)果(圖7-A-B)顯示，接種亞洲玉米螟后，轉(zhuǎn)基因玉米YA108對靶標(biāo)害蟲玉米螟有很好的控制作用，其植株葉片表面光滑無空洞，食葉級別均為1級，抗性水平為高抗。而相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因玉米葉片有較多缺刻及蟲孔，蟲食嚴(yán)重，食葉級別為7級，表現(xiàn)為感蟲，YA108葉片危害級別明顯低于非轉(zhuǎn)基因玉米。表明轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因玉米材料YA108對亞洲玉米螟有很好的抗性。

室內(nèi)花絲玉米螟抗蟲鑒定結(jié)果(圖7-C-D)顯示，非轉(zhuǎn)基因玉米花絲蟲食嚴(yán)重，表現(xiàn)為感蟲；而轉(zhuǎn)基因玉米YA108花絲抗蟲效果明顯，均達到高抗水平，抗蟲性表現(xiàn)穩(wěn)定。

吐絲期將玉米螟幼蟲接于玉米花絲，收獲時觀察玉米莖稈和穗部玉米螟危害程度，結(jié)果顯示(圖7-E-F)，轉(zhuǎn)基因玉米YA108莖稈和穗部受害微小或者不受害，抗性級別為高抗，而非轉(zhuǎn)基因玉米莖稈和穗部受害較嚴(yán)重，屬于感蟲級別，說明轉(zhuǎn)基因玉米YA108對玉米螟有很強的抗性。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲玉米材料已成為控制玉米螟危害的一種重要手段[19]。王艷輝等[20]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將改造合成的Cry1Ab/Ac抗蟲基因?qū)胗衩祝@得了抗蟲效果明顯的玉米株系；王悅冰等[2]將經(jīng)過2次密碼子優(yōu)化的抗蟲基因Cry1Ah導(dǎo)入玉米，獲得了抗蟲蛋白高效表達的轉(zhuǎn)基因株系。國家玉米改良中心賴錦盛課題組[21]通過共轉(zhuǎn)化的方法將改造后的Bt基因轉(zhuǎn)入玉米基因組，獲得了抗蟲性大幅度提高的優(yōu)良抗蟲轉(zhuǎn)化體。李圣彥等[22]利用密碼子優(yōu)化Btcry1Ah基因，獲得了Btcry1Ah基因表達增強的轉(zhuǎn)基因玉米。劉洋等[23]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法獲得了轉(zhuǎn)基因材料HiII-NGc-1 ，通過PCR、RT-PCR和試紙條的檢測，結(jié)合除草劑和玉米螟生測試驗，獲得了抗蟲、抗除草劑雙價轉(zhuǎn)基因玉米自交系。常雪等[24]分別將Cry1Ab/Cry2A和Cry1Ab/vip3DA轉(zhuǎn)入玉米自交系中，獲得抗蟲效果較好的轉(zhuǎn)化體。另外，轉(zhuǎn)Cry1Ab、Cry2Aj基因玉米雙抗12-5對黏蟲、亞洲玉米螟具有較好的抗性[25]。上述研究結(jié)果說明，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將優(yōu)化改造的抗蟲基因轉(zhuǎn)化玉米可以得到抗蟲性增強的玉米新材料，是一種可行、有效的抗蟲玉米育種方法。本研究將前期構(gòu)建的含有優(yōu)化改造合成的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲基因Cry1Ab-t的植物表達載體導(dǎo)入具有高效轉(zhuǎn)化效率的玉米雜交種HiIIB基因組中，獲得了82個轉(zhuǎn)基因玉米植株；采用PCR、RT-PCR、ELISA等方法對轉(zhuǎn)基因材料進行了轉(zhuǎn)基因植株鑒定，成功獲得了高抗玉米螟的轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因抗蟲玉米材料YA108。

玉米在整個生長季常常遭受多種害蟲危害，亞洲玉米螟是我國玉米上的第一大害蟲，在全國玉米產(chǎn)區(qū)廣泛分布。美國孟山都公司研發(fā)的第1代轉(zhuǎn)Bt基因玉米Mon810對亞洲玉米螟和歐洲玉米螟具有較高的田間抗蟲性[26]。在我國，轉(zhuǎn)Cry1Ab基因玉米對亞洲玉米螟具有較好的田間抗蟲效果[27-28]。張爽等[29]對轉(zhuǎn)基因玉米CM8101在心葉期和吐絲期進行田間接蟲鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米CM8101對亞洲玉米螟具有顯著的殺蟲效果。孫紅煒等[30]研究玉米雜交種瑞豐1號對亞洲玉米螟的抗性發(fā)現(xiàn)，田間鑒定結(jié)果表明，在心葉期接蟲瑞豐1號，瑞豐1號對亞洲玉米螟的抗性達到高抗水平。在本研究中，玉米花絲接蟲試驗表明，非轉(zhuǎn)基因玉米花絲蟲食嚴(yán)重，表現(xiàn)為高感玉米螟；而轉(zhuǎn)基因玉米YA108花絲抗蟲效果明顯，均達到高抗水平，抗蟲性表現(xiàn)穩(wěn)定；吐絲期接蟲試驗表明，非轉(zhuǎn)基因玉米接蟲后期被咬食嚴(yán)重，莖稈多處有蛀孔，傷口處大多有霉菌，而轉(zhuǎn)基因玉米YA108沒有受到危害。田間接蟲后，無論葉片和花絲，轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因抗蟲玉米材料YA108對亞洲玉米螟都具有非常好的抗性，能夠短時間殺滅玉米螟幼蟲，并極大程度減少了由于蟲害引起的霉變。綜上，抗蟲玉米材料YA108田間抗蟲性等級為1級，抗性水平為高抗，本研究為培育優(yōu)良的抗蟲玉米自交系奠定了基礎(chǔ)。