溫友偉，吳秀菊，李?lèi)?ài)雨，劉 丹，王麗娟

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

近年來(lái)，隨著冶煉、電鍍工業(yè)、采礦業(yè)的蓬勃發(fā)展，伴隨而來(lái)的是環(huán)境污染問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重，尤其是重金屬污染問(wèn)題[1]。鎘以移動(dòng)速度快、毒性強(qiáng)、污染面廣成為所有重金屬污染物中危害最嚴(yán)重的，被列為“五毒之首”[2]。有研究表明，排到環(huán)境中的鎘大概有90%進(jìn)入土壤，其中相當(dāng)部分為農(nóng)業(yè)土壤[3]。玉米是我國(guó)乃至全世界最重要的糧食作物之一，在重金屬污染日益嚴(yán)峻的情況下，安全生產(chǎn)玉米具有重要意義。

稀土元素，位于元素周期表中的第6 周期第Ⅲ副族，包括原子系數(shù)從 57 到 71 的鑭、鈰等15 個(gè)元素及性質(zhì)極為相似的釔、鈧共 17 個(gè)元素[4]。我國(guó)最早的稀土農(nóng)用開(kāi)始于20世紀(jì)70年代。 近些年研究表明，農(nóng)用稀土既是一種微肥，也是一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，作為微肥可促進(jìn)作物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可增強(qiáng)植物葉片的光合作用，提高葉綠素含量，增強(qiáng)抗病、抗逆能力，同時(shí)具有緩解重金屬毒害的作用[5]。

RNA-seq也被稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),其主要是應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)全面快速地得到所要研究樣本的近乎全部的轉(zhuǎn)錄本,進(jìn)而反映出它們的表達(dá)水平[6]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以玉米為試驗(yàn)材料，研究稀土鑭緩解玉米鎘脅迫的生理生化特性以及通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析預(yù)測(cè)鑭緩解玉米鎘脅迫可能涉及的分子代謝通路。為后續(xù)針對(duì)稀土響應(yīng)重金屬脅迫的相關(guān)研究提供了候選分子資源。

1 材料和方法

1.1 供試材料與試劑

供試玉米(Zea maysL.)品種：黑龍江地區(qū)常見(jiàn)玉米品種先玉696(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院孫彥坤老師提供)。

供試土壤：土壤購(gòu)于黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)花卉市場(chǎng)，其基本理化性質(zhì)為：pH值6.5，有機(jī)質(zhì)7.35 g/kg，總N含量19.52 mg/kg，總P含量16.2 mg/kg，總K含量35.23 mg/kg。

稀土鑭：來(lái)自上海國(guó)藥試劑集團(tuán)生產(chǎn)的氯化鑭，純度為分析純。

重金屬鎘：來(lái)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的氯化鎘，純度為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米種子的處理以及土壤的預(yù)處理 將土壤進(jìn)行高溫滅菌處理(121 ℃，30 min)，用蒸餾水配制鎘溶液，將鎘溶液均勻的噴施于高溫滅菌的土壤上，使鎘離子在土壤中的濃度達(dá)到0，5，7，10，15 mg/kg，選用直徑為20 cm的花盆，每盆裝1.5 kg噴施鎘的土，靜置7 d待用，每個(gè)處理重復(fù)3次。

將玉米種子用0.1%的HgCl2消毒10 min，然后用無(wú)菌水沖洗7次。選用直徑15 cm的培養(yǎng)皿，皿內(nèi)以雙層濾紙為發(fā)芽床，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放入50粒處理好的玉米種子，置于恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)，溫度控制在25 ℃。待培養(yǎng)皿中的種子胚根長(zhǎng)到3～5 cm，胚芽長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，將其移種到事先處理好的土壤中，每盆3株。將其置于恒溫溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在25 ℃。待玉米幼苗長(zhǎng)出第3片真葉時(shí)噴施鑭溶液，噴施標(biāo)準(zhǔn)以鑭溶液滴液為限。幼苗生長(zhǎng)期為一個(gè)月，到時(shí)取樣。

1.2.2 鎘濃度的選擇 將發(fā)芽狀態(tài)良好的玉米種子種植在含有不同濃度(0，5，7，10，15 mg/kg)鎘離子的土壤中。本試驗(yàn)采用電導(dǎo)儀法測(cè)定質(zhì)膜透性，采用MDA法測(cè)定植物組織膜脂過(guò)氧化。MDA含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。通過(guò)這2個(gè)指標(biāo)結(jié)合玉米生長(zhǎng)量確定后續(xù)試驗(yàn)的鎘濃度。

1.2.3 鑭濃度的選擇 配制10，20，40 mg/L氯化鑭溶液，均勻噴布玉米葉片。本試驗(yàn)選取玉米幼苗葉片葉綠素含量以及葉片質(zhì)膜透性2個(gè)指標(biāo)，再結(jié)合噴施鑭溶液對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)量的影響作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行適宜鑭濃度的篩選。葉綠素含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.2.4 噴施鑭對(duì)鎘脅迫玉米幼苗生理生化指標(biāo)的影響 玉米幼苗生長(zhǎng)量采用直接測(cè)量法。試驗(yàn)所測(cè)的葉綠素含量、MDA含量、抗氧化酶活性均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)定與分析 對(duì)鑭處理下鎘脅迫玉米根部樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。委托百邁克生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘濃度的選擇

本試驗(yàn)采用電導(dǎo)儀法測(cè)定質(zhì)膜透性(以鮮質(zhì)量計(jì))，采用MDA法測(cè)定植物組織膜脂過(guò)氧化。結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，在土壤Cd2+濃度為7 mg/kg或者濃度更高時(shí)，質(zhì)膜透性顯著上升。在土壤鎘濃度為5 mg/kg或者濃度更高時(shí)，MDA含量(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著上升。玉米幼苗生長(zhǎng)量見(jiàn)表1，在土壤鎘濃度為7 mg/kg或者濃度更高時(shí)，幼苗生長(zhǎng)量顯著降低。最終選擇7 mg/kg的土壤鎘濃度作為后續(xù)試驗(yàn)濃度。

表1 鎘脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)量的影響Tab.1 Effect of cadmium stress on the growth of maize seedlings

2.2 鑭濃度的選擇

取玉米幼苗葉片葉綠素含量以及葉片質(zhì)膜透性2個(gè)指標(biāo)結(jié)合噴施鑭溶液對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)量的影響作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行適宜鑭濃度的篩選。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。噴施不同濃度(10，20，40 mg/L)的鑭溶液，都能降低質(zhì)膜透性(以鮮質(zhì)量計(jì))以及提高葉綠素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))。其中質(zhì)膜透性的降幅為1.06，1.42，0.69百分點(diǎn)。葉綠素含量的分別增長(zhǎng)為20.73%，37.31%，10.88%。通過(guò)表2可以得到，在噴施20 mg/L鑭溶液時(shí)，玉米幼苗的生長(zhǎng)量提升最大。綜上所述，選擇20 mg/L為試驗(yàn)中噴施鑭溶液的濃度。

表2 噴施鑭溶液對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)量的影響Tab.2 Effect of spraying lanthanum solution on the growth of maize seedlings

2.3 噴施鑭對(duì)鎘脅迫玉米幼苗生理生化指標(biāo)的影響

從前面的試驗(yàn)中選出了試驗(yàn)所采用的鎘濃度為7 mg/kg，鑭濃度為20 mg/L。玉米幼苗結(jié)果見(jiàn)表3。測(cè)得在經(jīng)過(guò)7 mg/kg鎘處理的玉米幼苗地上部苗長(zhǎng)降幅為21.77%，苗質(zhì)量降幅為45.39%。根長(zhǎng)降幅為47.45%，根質(zhì)量降幅為50%。當(dāng)噴施20 mg/L鑭溶液時(shí)，鎘脅迫玉米幼苗生長(zhǎng)量的降幅明顯變小，其苗長(zhǎng)降幅為6.20%，苗質(zhì)量降幅為29.75%，根長(zhǎng)降幅為15.41%，根質(zhì)量降幅為14.91%。葉綠素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))見(jiàn)圖3-A?？梢园l(fā)現(xiàn)單獨(dú)鎘處理玉米葉片葉綠素含量顯著下降。單獨(dú)噴施鑭溶液，葉綠素含量顯著上升。鎘處理的基礎(chǔ)上噴施鑭溶液葉

表3 噴施鑭溶液對(duì)鎘脅迫玉米幼苗生長(zhǎng)量的影響Tab.3 Effect of spraying lanthaunm solution on the growth of maize seedlings under cadmium stress

綠素含量比CK稍微低一點(diǎn)，但是比單獨(dú)鎘處理要高。MDA含量(以鮮質(zhì)量計(jì))(圖3-B)的變化趨勢(shì)與葉綠素含量正好相反。本試驗(yàn)測(cè)定了SOD、POD、CAT3種抗氧化酶的活性(以鮮質(zhì)量計(jì))，結(jié)果如圖3-C-E所示，3種抗氧化酶在受到單獨(dú)鎘脅迫時(shí)，酶活性都會(huì)顯著上升，而SOD酶活性的增幅要大于POD和CAT，表明SOD酶活性是玉米幼苗遭受脅迫時(shí)比較敏感的生物標(biāo)記物。當(dāng)在鎘脅迫的基礎(chǔ)上噴施鑭溶液后，SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶活性與單獨(dú)鎘脅迫時(shí)都顯著下降，但是還是要比CK高，表明噴施鑭溶液后，玉米幼苗體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生減少，玉米幼苗受到的鎘脅迫得到緩解，但是不會(huì)恢復(fù)到正常的狀態(tài)。綜上所述，得知，在噴施20 mg/L鑭溶液后，鎘脅迫玉米幼苗得到緩解。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)定與差異表達(dá)基因分析

2.4.1 測(cè)序統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量分析 從鎘處理(7 mg/kg)和在鎘處理(7 mg/kg)的基礎(chǔ)上噴施鑭溶液(20 mg/L)的玉米的根中分別提取RNA，構(gòu)建樣品cDNA文庫(kù)，基于邊合成邊測(cè)序(Sequencing By Synthesis，SBS)技術(shù)，Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，共獲得37.64 Gb Clean Base，各樣品Clean Base最低為5 789 701 560 bp，Q30堿基[7]百分比在94.43%及以上。數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)Tab.4 Sample transcriptome sequencing data

2.4.2 差異表達(dá)基因功能注釋 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋?zhuān)鞑町惐磉_(dá)基因集注釋到的基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表5。從樣本數(shù)據(jù)庫(kù)中總共篩選到1 271條差異基因，有1 268條被注釋到NR(Non-redundant protein sequence database)數(shù)據(jù)庫(kù)中，1 013條被注釋到Pfam(The database of Homologous protein family)數(shù)據(jù)庫(kù)中，951條被注釋到Swiss-Prot(A manually annotated, non-redundant protein sequence database)數(shù)據(jù)庫(kù)中。

表5 注釋的差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.5 Annotated differentially expressed genes quantitative statistics

2.4.3 差異表達(dá)基因GO分析 GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)是GO組織(Gene Ontology Consortium)于2000年構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，其目的是建立基因及其產(chǎn)物知識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)詞匯體系。在本次試驗(yàn)的差異基因中共有1 020個(gè)基因用于GO分類(lèi)分析(圖4)，分為50個(gè)功能亞類(lèi)，從屬于3個(gè)主要分支，即生物學(xué)過(guò)程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細(xì)胞組分(Cellular component)。各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，以及所處的細(xì)胞環(huán)境和參與的生物學(xué)過(guò)程。在生物學(xué)過(guò)程中DNA整合(DNA integration)所占的比例最高，為15.66%。在分子功能中RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ regulatory region sequence-specific DNA binding)所占的比例最高，為8.14%。在細(xì)胞組分中膜的組成部分(Integral component of membrane)所占的比例最高，為19.32%。

2.4.4 差異表達(dá)基因COG分析 COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)數(shù)據(jù)庫(kù)是基于細(xì)菌、藻類(lèi)、真核生物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建得到的，利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類(lèi)。在篩選出的差異基因中有428條差異基因用于COG分類(lèi)，分別歸類(lèi)于COG分類(lèi)的25個(gè)功能類(lèi)別。在分類(lèi)中，碳水化合物的運(yùn)輸和代謝障礙(Carbohydrate transport and metabolism)中表達(dá)的差異基因有61條，其數(shù)量是在所有差異基因的比例是最高的，接下來(lái)是脂質(zhì)運(yùn)輸和新陳代謝(Lipid transport and metabolism)、僅一般功能預(yù)測(cè)(General function prediction only)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(Signal transduction mechanisms)，其差異基因數(shù)量分別為46,44，41。被歸類(lèi)到細(xì)胞內(nèi)性腺激素的分泌和囊泡運(yùn)輸(Intracellular

trafficking, secretion, and vesicular transport)的差異基因只有1條。此外，在COG的25個(gè)功能分類(lèi)中，還有3個(gè)功能沒(méi)有沒(méi)有篩選出差異基因，它們分別是RNA加工和修飾(RNA processing and modification)、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)(Chromatin structure and dynamics)、核結(jié)構(gòu)(Nuclear structure)。差異表達(dá)基因COG注釋分類(lèi)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖5。

2.4.5 差異表達(dá)基因KEGG Pathway富集分析 分析差異表達(dá)基因在某一通路上是否發(fā)生顯著差異即為差異表達(dá)基因的通路富集分析。差異表達(dá)基因KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖6。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在淀粉和蔗糖代謝途徑(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Plant hormone signal transduction)和苯丙烷生物合成途徑(Phenylpropanoid biosynthesis)富集最為顯著，推測(cè)鑭緩解鎘脅迫可能和這4條通路有關(guān)。

3 討論

鎘作為一種非生命所必需的重金屬，具有比較強(qiáng)的生物學(xué)毒性，被稱(chēng)為“五毒之首”[2,8-9]。本研究表明，鎘對(duì)玉米幼苗具有明顯的抑制作用，且隨著鎘濃度的升高，其抑制現(xiàn)象越明顯，表現(xiàn)在生長(zhǎng)量下降，抗氧化酶上升，膜脂過(guò)氧化程度(MDA含量)增加，葉綠素含量下降，與劉冰等[10]的研究一致。玉米作為糧食作物，在土壤重金屬鎘污染情況日益加劇的情況下，找到緩解玉米鎘中毒的方法就變得越發(fā)重要[11-12]。

稀土作為一種緩釋劑已經(jīng)在農(nóng)業(yè)中廣泛推廣[13]。大量研究證明，稀土元素在濃度適量的情況下可以提高植物種子萌發(fā)率, 增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫的能力和提高植物的抗病性[14-16], 本研究證明與鎘處理相比，后噴施適宜濃度鑭溶液玉米幼苗的生長(zhǎng)量提高，葉綠素含量有所上升，MDA含量有所下降，抗氧化酶活性也有所下降，說(shuō)明鎘脅迫得到了緩解，這與黃曉華等[15]研究得到的稀土能增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫的能力一致。

隨著科學(xué)技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為植物相關(guān)研究必不可少的技術(shù)手段之一[17]。逆境是造成作物減產(chǎn)最主要的原因之一[18]，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以了解作物與抗逆相關(guān)的分子機(jī)制，為培育出抗逆性強(qiáng)的作物品種提供分子基礎(chǔ)。水稻[19]、小麥[20]、玉米[21]等重要的糧食作物通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選得到了大量的脅迫響應(yīng)基因，為作物豐產(chǎn)提供了保障。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Σ町惐磉_(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在淀粉和蔗糖代謝途徑(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Plant hormone signal transduction)和苯丙烷生物合成途徑(Phenylpropanoid biosynthesis)富集最為顯著，推測(cè)鑭緩解鎘脅迫可能與這4條通路有關(guān)。具體的緩解機(jī)制有待后續(xù)研究。

綜上所述，噴施適宜濃度的稀土鑭溶液可以在一定程度上緩解玉米幼苗受到的鎘脅迫。其緩解的分子機(jī)制可能與淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成途徑有關(guān)。