王 凌，張國(guó)印，劉孟朝，孫世友，劉 蕾，茹淑華，趙歐亞，李博文

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，河北 石家莊 050051；3.河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050051)

菜田氮養(yǎng)分調(diào)控是減施肥料增效的核心關(guān)鍵，其中微生物在氮元素的循環(huán)中發(fā)揮了重要作用[16-17]。近幾年，利用硝化抑制劑調(diào)控氮素循環(huán)的研究方興未艾。由于其效果好、成本低、對(duì)環(huán)境的危害小等優(yōu)點(diǎn)在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，常用的硝化抑制劑有雙氰胺(DCD)、2-氯-6三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)、3-4甲基吡唑磷酸鹽(DMPP)等。它們?cè)谛挛魈m高氮草地、中國(guó)南方酸性水稻土及亞熱帶蔬菜土壤中提高土壤氮肥效率、減少硝酸鹽淋失、降低溫室氣體排放以及提高作物產(chǎn)量等方面已有些報(bào)道[18-27]。然而，在我國(guó)華北集約化菜田的石灰性土壤中，運(yùn)用硝化抑制劑減少氮源氣體，特別是氮氧化物(NOx)的排放報(bào)道較少，尤其是與氨氧化古菌AOA的作用關(guān)系更是鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)深入研究并明晰了硝化抑制劑施用和肥料減施對(duì)減少設(shè)施菜田NOx、N2O等氮源氣體排放及與氨氧化古菌AOA的作用關(guān)系，并應(yīng)用高通量Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序，利用PICRUSt對(duì)16S rDNAV3-V4區(qū)基因系列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)與氮代謝相關(guān)的功能基因進(jìn)行了鑒定。為提高華北設(shè)施菜田養(yǎng)分利用率，有效防控農(nóng)業(yè)面源污染，切實(shí)保障蔬菜食品安全和生態(tài)環(huán)境安全，促進(jìn)我國(guó)農(nóng)業(yè)高質(zhì)量綠色發(fā)展提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試土壤

本試驗(yàn)設(shè)置于國(guó)家農(nóng)業(yè)部鹿泉農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站-石家莊市鹿泉市大河鎮(zhèn)河北省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)站內(nèi)溫室中，開(kāi)始于2015年，連續(xù)種植至今。該地屬于河北山前平原區(qū)、溫帶大陸性季風(fēng)氣候，土壤類(lèi)型為石灰性褐土，其表層土壤(0～20 cm)基礎(chǔ)理化性質(zhì)如下：硝態(tài)氮60.2 mg/kg，銨態(tài)氮1.01 mg/kg，有效磷28.37 mg/kg，速效鉀73.50 mg/kg，全氮1.14 g/kg，全磷0.82 g/kg，全鉀19.19 g/kg，有機(jī)質(zhì)14.32 g/kg，pH值8.2，容重1.45 g/cm3。

1.2 試驗(yàn)材料

供試植物為黃瓜，品種為津優(yōu)1號(hào)。DCD為雙氰胺分析純化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品；吡啶為2-氯-6-三氯甲基吡啶，活性成分含量為200 g/L，美國(guó)陶氏益農(nóng)公司出品；供試氮磷鉀肥料分別為尿素 (N 含量 46%)、重過(guò)磷酸鈣 (P2O5含量46%)、氯化鉀 (K2O含量60%)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)處理：不施肥的空白對(duì)照(處理CK)，農(nóng)民常規(guī)施肥(處理FT)，常規(guī)施肥增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)，常規(guī)施肥增施硝化抑制劑吡啶(處理In-2)，常規(guī)施用量的基礎(chǔ)上減量25%施肥(處理OPT)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，各處理的施肥方案如表2所示，DCD和吡啶用量均為施氮量的15%[27]。作物統(tǒng)一管理，肥料總施用量如表1，有機(jī)肥隨底肥一次性施入，化肥在底肥時(shí)期施入總投入量的60%，后期分別在花期追肥1次(為總投入量的10%)，果期追肥2次(先后分別為總投入量的20%和10%)。硝化抑制劑隨化肥一同通過(guò)追肥罐隨水施入。灌水采用滴灌方式，用土壤時(shí)域反射儀TDR(Time Domain Reflectometry)進(jìn)行土壤水分的監(jiān)測(cè)，保持田間持水量70%，每一生長(zhǎng)季共灌溉5次，全生育期總灌溉量約為3 375 m3/hm2。作物生長(zhǎng)周期均為120 d。

表1 不同施肥處理氮調(diào)控試驗(yàn)的肥料施用量Tab.1 The different treatments with different fertilizer input in nitrification process regulation experiment

1.4 氮源氣體及土壤樣品采集及測(cè)定方法

在黃瓜完整生長(zhǎng)周期內(nèi)每次追肥和灌溉后，連續(xù)采集7～10 d的氮氧化物(NOx)、氧化亞氮(N2O)等氮源氣體樣品。氮源氣體各年度數(shù)據(jù)規(guī)律趨同，本研究采用數(shù)據(jù)為2018年采集；氮肥偏生產(chǎn)力的數(shù)據(jù)為2015-2020年采集。

在黃瓜完整生長(zhǎng)周期內(nèi)的初花期、盛瓜期、末瓜期等各個(gè)時(shí)期，尤其是每次追肥和灌溉后，連續(xù)記錄7～10 d的溫度、濕度條件參數(shù)，開(kāi)展了氧化亞氮(N2O)、氮氧化物(NOx)等氮源氣體的定位監(jiān)測(cè)，掌握不同處理的排放規(guī)律。

氧化亞氮(N2O)氣體的采集與測(cè)定：采用密閉式靜態(tài)箱法[28]，箱體由兩部分組成：上部箱體為體積為長(zhǎng) 0.5 m、寬0.5 cm、高0.5 m的不銹鋼框架+亞克力面板，外面包裹保溫棉制成，箱體頂部設(shè)一氣體取樣口，底部開(kāi)口可罩在底座上；下部底座為結(jié)合部位為不銹鋼框的正方形(橫截面)U型(縱剖面)水槽內(nèi)，底座插入 25 cm 土層中固定。抽氣取樣時(shí)，水封槽內(nèi)注滿水，然后將氣密室密封罩扣入有水槽的底座上，形成一個(gè)密閉性氣體空間，密閉后采用箱內(nèi)的風(fēng)扇將氣體攪勻。底肥和每次追肥后(水肥一體化追肥，硝化抑制劑一同施入)，連續(xù)采樣 7～10 d，采樣時(shí)間為每天10:00-12:00，每次分別在 0，10，20 min收集密閉箱之氣樣，并記錄采集氣樣的同步時(shí)間內(nèi)采樣箱內(nèi)溫度。利用針管采集35 mL氣體到20 mL密封且提前抽真空的玻璃氣瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室后，用氣相色譜(Agilent7890B，美國(guó))進(jìn)行氣體樣品N2O含量的測(cè)定。

氮氧化物(NOx)的采集與測(cè)定：方法與上述N2O的采集方法相同，將采集到的氣體樣品先轉(zhuǎn)移到預(yù)先抽真空的容積為 200 mL 的氣袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后，采用化學(xué)發(fā)光法[29](Thermo 42i氮氧化物分析儀，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。

其中：F為N2O或NOx排放通量(g/(hm2·d))，ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下被測(cè)氣體的密度(g/L),H為箱子高度(cm)，P為采樣點(diǎn)大氣壓強(qiáng)(100 kPa)，P標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下大氣壓強(qiáng)(100 kPa)，ΔC/Δt為單位時(shí)間內(nèi)被測(cè)氣體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化速率(μg/(g·min))。

其中：N2O/NOx排放總量Q單位為kg/hm2；F為N2O/NOx排放通量為g/(hm2·d)，i為按時(shí)間排序的采樣，n為作物生育期總采樣次數(shù)。

土壤樣品采集與微生物功能基因測(cè)定：黃瓜收獲以后，分別采集用于測(cè)定土壤常規(guī)理化指標(biāo)的表層(0～20 cm)土壤樣品2 kg，以及進(jìn)行微生物多樣性和功能基因分析的根際土壤樣品適量。表層土壤樣品采集，用“S”法均勻采取蔬菜采樣點(diǎn)的根系土深度約為0～20 cm，土樣充分混合后，四分法留取重量約為1 kg，鮮樣0～4 ℃冷藏備測(cè)；風(fēng)干樣品，過(guò)2 mm篩備測(cè)。用于土壤理化指標(biāo)包括銨態(tài)氮、硝態(tài)氮，有機(jī)質(zhì)，pH值等的分析測(cè)定[30]。關(guān)于進(jìn)行土壤微生物功能基因的樣品采集，對(duì)于每棵黃瓜根系，都有大約20 cm深的土壤核心，將根際浮土進(jìn)行人工抖動(dòng)去除，用去離子水沖洗根際土每株根約100 mL并微波震蕩，每棵植株的距離為15～20 cm。將每個(gè)小區(qū)連續(xù)采集3棵黃瓜植株根際土壤進(jìn)行混合，這些根際土被用于DNA提取[31]。本研究采用的微生物功能基因數(shù)據(jù)為2020年采集的土壤樣品測(cè)得。

對(duì)參與氮代謝的功能基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并在高通量Illumina MiSeq系統(tǒng)平臺(tái)測(cè)序，氨氧化古菌AOAamoA基因引物信息如下：Arch-amoA26F:5′-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC-3′；Arch-amo

A417R:5′-GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG-3′[32]。

氮肥偏生產(chǎn)力的計(jì)算：根據(jù)作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和氮肥施用量計(jì)算氮肥偏生產(chǎn)力(Partial Factor Productivity of Nitrogen，PFPN)，公式為：PFPN(kg/kg)= 作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量/肥料氮投入量[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化抑制劑施用和肥料減施對(duì)設(shè)施黃瓜菜田氮氧化物排放的影響

由圖1顯示，在基肥施入播種后的7 d以及追肥后的7 d，均為農(nóng)田氮氧化物NOx排放較高的時(shí)期，增施硝化抑制劑可顯著抑制華北設(shè)施菜田氮氧化物NOx的排放。各施肥處理中以常規(guī)施肥(處理FT)下的NOx排放通量最大，峰值為139.3 g/(hm2·d)；與常規(guī)施肥(處理FT)相比，增施DCD(處理In-1)和吡啶(處理In-2)均使氮氧化物(NOx)排放量有明顯降低，除不施肥的對(duì)照(處理CK)外，以增施DCD(處理In-1)的NOx排放通量最低。由圖2可知，增施DCD(處理In-1)的NOx排放總量顯著低于其他施肥處理，分別比農(nóng)民常規(guī)施肥處理(FT)和減量施肥處理(OPT)的NOx排放總量減少了76.5%，71.8%。

2.2 硝化抑制劑施用和肥料減施對(duì)設(shè)施黃瓜農(nóng)田土壤N2O排放的影響

如圖3所示，增施硝化抑制劑和減量施肥均能有效降低氧化亞氮(N2O)的排放，且基肥施用后N2O排放通量顯著高于追肥。各施肥處理間，常規(guī)施肥(處理FT)的N2O排放通量最高，最大排放通量達(dá)108.3 g/(hm2·d)，以增施硝化抑制劑吡啶(處理In-2)下N2O排放通量最低，較常規(guī)施肥(處理FT)下降31.2%。由圖4可見(jiàn)，設(shè)施黃瓜菜田全生育期各處理的氧化亞氮(N2O)排放總量差異顯著，常規(guī)施肥(處理FT)排放總量最大，以減量施肥(處理OPT)最低；減量施肥(OPT)、施用硝化抑制劑DCD(處理In-1)和吡啶(處理In-2)三者的N2O排放總量顯著低于常規(guī)施肥(處理FT)，降幅分別為28.4%，21.8%，20.6%，三者間差異不顯著。

2.3 硝化抑制劑施用和肥料減施對(duì)氨氧化古菌AOA的影響及其與NOx排放量之間的作用關(guān)系

2.3.1 不同施肥處理對(duì)氨氧化古菌AOA的amoA基因拷貝數(shù)的影響 如圖5結(jié)果顯示，在第5年當(dāng)季施入各處理投入品40 d時(shí)，土壤中氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數(shù)存在顯著差異(P<0.05)。與常規(guī)施肥(處理FT)相比，在增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)的調(diào)控下，土壤中氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數(shù)受到了抑制，僅為農(nóng)民常規(guī)施肥(處理FT)的20%；增施吡啶(處理In-2)未對(duì)氨氧化古菌AOA的數(shù)量產(chǎn)生顯著影響；而減量25%施肥(處理OPT)的氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數(shù)，與農(nóng)民常規(guī)施肥(處理FT)相比均有明顯下降，降幅分別達(dá)29.8%，但仍顯著高于增施硝化抑制劑DCD(In-1)的處理。結(jié)果表明，施用肥料特別是有機(jī)肥，會(huì)使耕層土壤中氨氧化古菌AOA數(shù)量顯著提升，但在相同施肥量的條件下，增施硝化抑制劑DCD(處理In-1) ，與常規(guī)施肥(處理FT)相比，會(huì)顯著抑制土壤中氨氧化古菌AOA數(shù)量，從而達(dá)到了抑制氨氧化作用的目的，減少氮素在農(nóng)田中的損失。

2.3.2 氨氧化古菌AOA與設(shè)施菜田NOx排放量的關(guān)系 通過(guò)分析氨氧化功能基因與NOx排放量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數(shù)和設(shè)施菜田NOx排放總量之間存在顯著的指數(shù)型方程關(guān)系(圖6)，其方程如下：

Y= 121.18e3E-08x,R2=0.840 5,P<0.05

Y是設(shè)施菜田單位面積內(nèi)NOx排放總量，x是在當(dāng)季施入各處理投入品40 d時(shí)所采集的土壤樣品進(jìn)行的qPCR擴(kuò)增分析而得的氨氧化古菌AOA的數(shù)量。隨著氨氧化古菌AOA種群數(shù)量的增加，設(shè)施菜田NOx排放總量方程銳升的趨勢(shì)。

2.4 硝化抑制劑和減量施肥調(diào)控下微生物功能基因響應(yīng)

圖7所示，在硝化抑制劑和肥料減量施用的調(diào)控下，對(duì)豐度前50位已知的最小單元功能群類(lèi)的直系同源基因簇進(jìn)行聚類(lèi)分析，以進(jìn)行物種身份與功能通路對(duì)應(yīng)關(guān)系比對(duì)，對(duì)該環(huán)境下物種組成功能基因挖掘具有重要意義。PICRUSt預(yù)測(cè)法分析的結(jié)果表明，紅色條塊代表在對(duì)應(yīng)樣本中豐度較高的功能類(lèi)群，對(duì)照KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝功能，除不施肥的對(duì)照(處理CK)外，減量25%施肥(處理OPT)以及硝化抑制劑(處理In-2)下，烯酰水合酶(Enoyl-CoA hydratase，K01692)、底物結(jié)合蛋白(Substrate-binding protein，K02035)和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白(Trans-port system ATP-binding protein，K09687)系統(tǒng)代謝通路相關(guān)的功能基因相對(duì)豐度高，是響應(yīng)上述調(diào)控變化最為敏感的氮循環(huán)途徑。該發(fā)現(xiàn)將為數(shù)百個(gè)未開(kāi)發(fā)的氮循環(huán)功能微生物群落提供有用的見(jiàn)解，為下一步深入研究提高功能微生物的作用效率奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.5 硝化抑制劑調(diào)控在設(shè)施黃瓜菜田系統(tǒng)下的肥料利用率方面差異分析

由表2可知，減量施肥(處理OPT)的肥料偏生產(chǎn)力是各施肥處理中最高的。5 a間，與常規(guī)施肥(處理FT)相比，減量施肥(處理OPT)的肥料偏生產(chǎn)力提升了32.1%～38.2%，且與其他處理差異顯著，但后2 a有下降的趨勢(shì)，有待后續(xù)試驗(yàn)觀察；增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)的偏生產(chǎn)力也較高，與常規(guī)施肥(處理FT)相比提升了17.8%～21.9%，且差異顯著。結(jié)果表明，在該試驗(yàn)土壤肥力水平下，減量施肥和增施硝化抑制劑均可顯著提高肥料利用率，其效果排序?yàn)闇p量施肥>增施DCD>增施吡啶。

表2 硝化抑制劑調(diào)控下設(shè)施黃瓜菜田肥料偏生產(chǎn)力差異分析Tab.2 Analysis on the difference of partial factor productivity of fertilizer with nitrification inhibitor regulation in greenhouse cucumber field kg/kg

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

對(duì)比此前文獻(xiàn)報(bào)道，Di等[10,19]發(fā)現(xiàn)在新西蘭高氮草地酸性土壤施用DCD可使放牧草場(chǎng)系統(tǒng) N2O 氣體排放量降低了 75%～80%。Menéndez等[24]在西班牙北部的一種混合的三葉草-黑麥草草場(chǎng)應(yīng)用DMPP，使N2O和NO的排放量分別減少了29%和25%。Cui 等[25]的研究結(jié)果表明，在集約化的蔬菜生產(chǎn)系統(tǒng)的黃棕壤和潮土中，施用 DCD 使得N2O排放因子分別降低了83.8%和72.7%。本試驗(yàn)是在石灰性褐土中的結(jié)果，與上述報(bào)道的施用DCD可使N2O 氣體排放降低趨勢(shì)一致，而降低的排放量有所差異，推測(cè)與試驗(yàn)土壤的理化性質(zhì)及作物不同相關(guān)。并且，本研究涉及的硝化抑制劑對(duì)華北石灰性菜田土壤氮氧化物排放(NOx)的作用效果鮮有報(bào)道，為本試驗(yàn)的創(chuàng)新性研究結(jié)果。

此前報(bào)道顯示，Di等[18]在新西蘭高氮草地酸性土壤發(fā)現(xiàn)DCD可顯著抑制氨氧化細(xì)菌AOB的數(shù)量，但對(duì) AOA 無(wú)明顯影響，He等[20]在我國(guó)南方酸性紅壤水稻土發(fā)現(xiàn)DCD有顯著抑制氨氧化古菌AOA的效果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在北方石灰性褐土設(shè)施黃瓜菜田中，增施DCD可顯著抑制氨氧化古菌AOA種群數(shù)量，該結(jié)果既與高氮草地酸性土壤結(jié)果不同，又與我國(guó)南方酸性紅壤的土壤性質(zhì)不同，是對(duì)DCD在不同土壤類(lèi)型pH值及有機(jī)質(zhì)含量等理化性質(zhì)不同的環(huán)境中作用效果的又一有力補(bǔ)充。推測(cè)其原因可能在于不同土壤中優(yōu)勢(shì)氨氧化菌群對(duì)不同硝化抑制劑的敏感性不同有關(guān)[21]。并且本試驗(yàn)創(chuàng)新性地揭示了氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數(shù)與土壤NOx排放通量之間的函數(shù)關(guān)系。

該試驗(yàn)創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)我國(guó)北方石灰性菜田土壤中，響應(yīng)增施硝化抑制劑和肥料減量調(diào)控變化最為敏感的功能微生物氮循環(huán)代謝途徑，與此前報(bào)道對(duì)比，雖在微咸水、冰川流及厭氧處理等不同生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境[34-36]中參與氮循環(huán)的細(xì)菌代謝通路有所差異，但均證實(shí)了許多鮮為人知的、具有良好特性的功能細(xì)菌的存在。

該試驗(yàn)結(jié)果與此前報(bào)道的，在栽培基質(zhì)中、棕壤中減量施肥以及黃棕壤中施用DCD的報(bào)道結(jié)果接近[25,37-38]。田間條件下上述試驗(yàn)結(jié)果的持續(xù)再現(xiàn)性如何，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 結(jié)論

第一，北方設(shè)施黃瓜-土壤菜田系統(tǒng)中，增施硝化抑制劑和減量施肥均能有效降低氮氧化物(NOx)和氧化亞氮(N2O)的排放，特別是在底肥施用期效果最為顯著。增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)與常規(guī)施肥(處理FT)和減量施肥(處理OPT)相比，每年向環(huán)境排放的氮氧化物(NOx)排放總量分別減少76.5%和71.8%，減量施肥(處理OPT)和增施DCD分別比常規(guī)施肥(處理FT)氧化亞氮(N2O)年排放總量減少28.4%和21.8%。第二，本結(jié)果進(jìn)一步顯示，在北方石灰性褐土設(shè)施黃瓜菜田中，增施DCD可顯著抑制氨氧化古菌AOA種群數(shù)量，且綜合效果明顯優(yōu)于吡啶；此外，氨氧化古菌AOA對(duì)NOx排放起調(diào)控作用，氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數(shù)與土壤NOx排放通量之間呈指數(shù)正相關(guān)關(guān)系：Y=121.18e3E-08x(R2=0.840 5,P<0.05)，并且隨著氨氧化古菌AOA種群數(shù)量的增加，NOx的排放通量呈指數(shù)銳升。第三，本試驗(yàn)應(yīng)用高通量Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序，利用國(guó)際通用的PICRUSt工具對(duì)16S rDNAV3-V4區(qū)基因系列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果顯示，在肥料減施(處理OPT)和硝化抑制劑(處理In-2)調(diào)控的土壤中，與同化途徑相關(guān)的烯酰水合酶(K01692)、底物結(jié)合蛋白(K02035)以及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白(K09687)系統(tǒng)代謝通路相關(guān)的功能基因相對(duì)豐度高，是響應(yīng)上述調(diào)控變化最為敏感的氮循環(huán)途徑。第四，與常規(guī)施肥(處理FT)相比，5 a間，減量施肥(處理OPT)和增施DCD(處理In-1)的肥料偏生產(chǎn)力分別提升了32.1%～38.2%和17.8%～21.9%。綜上所述，在華北集約化設(shè)施菜田石灰性褐土中，增施硝化抑制劑和肥料減施可有效減少農(nóng)田氮源氣體排放，會(huì)顯著抑制氨氧化古菌AOA的數(shù)量，顯著提高肥料利用率，可有效防控農(nóng)業(yè)面源污染。