李 靚，于 卓，于肖夏，楊東升，盧倩倩，李景偉，李佳奇，劉宇飛

(內蒙古農業(yè)大學 農學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)起源于南美洲的秘魯、玻利維亞等短日照地區(qū)的安第斯山，約17紀中葉傳入中國，目前是僅次于水稻、小麥、玉米的世界第四大糧食作物[1]。馬鈴薯亦糧亦菜[2]，塊莖含有豐富的營養(yǎng)成分，素有“地下蘋果”的美稱。我國是馬鈴薯第一生產大國和消費大國[3]，種植面積和總產約占世界總面積和總產的1/4[4]，然而，與西方發(fā)達國家相比，我國馬鈴薯加工產業(yè)較滯后，特別是加工專用型及特色保健型彩色馬鈴薯品種缺乏。

專用型馬鈴薯品種分為鮮食專用型(包含塊莖為白肉和黃肉的普通鮮食型、塊莖薯肉為彩色的特色馬鈴薯)、薯條薯片油炸專用型、淀粉和全粉加工專用型等[5]。鮮食專用型馬鈴薯品種要求芽眼淺，薯塊淀粉含量13%～17%，食味好，不麻口，煎、炒時不易成糊狀。薯片或薯條油炸專用型馬鈴薯品種要求薯塊為圓形或長圓形，還原糖含量低于0.2%。淀粉加工專用型馬鈴薯品種要求薯塊淀粉含量19%以上[6]，全粉加工型馬鈴薯品種要求干物質含量24%以上，還原糖含量小于0.3%。目前，我國90%的馬鈴薯是以鮮食形式消費，僅有小部分用于加工利用[7]。今后馬鈴薯產業(yè)發(fā)展亟待選育優(yōu)質高產抗病性強的特色保健型的彩色馬鈴薯和加工專用型馬鈴薯新品種。

近幾年來，內蒙古農業(yè)大學馬鈴薯遺傳育種實驗室采用常規(guī)雜交及分子標記輔助選擇相結合的方法，選育出6個綜合農藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異的馬鈴薯新品系NNS-P 11、NNS-H 6、NNS-H 4、NNS-C 10、NNS-L 9和NNS-Y 40，本試驗擬采用常規(guī)制片法對這6個馬鈴薯新品系的花粉育性及其減數(shù)分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)染色體配對構型進行分析，以明確其細胞遺傳學差異；并利用具有共顯性的SSR(Simple sequence repeats)分子標記技術[8]分析各品系間在DNA水平上的遺傳差異，旨在為下一步的新品種育成和登記利用提供分子細胞遺傳學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與種植方式

材料為馬鈴薯新品系NNS-P 11(黑美人×MIN-021)、NNS-H 6(HLH×MIN-021)、NNS-H 4(HLH×MIN-021)、NNS-C 10(H027×黑美人)、NNS-L 9(隴薯7號×MIN-021)和NNS-Y 40(4Y×MIN-021)，對照材料為MIN-021。種薯由內蒙古農業(yè)大學馬鈴薯遺傳育種研究室提供，種薯級別為原種。試驗于2019年5-9月在托克托縣古城鎮(zhèn)南的力圖馬鈴薯育種試驗基地進行。土壤為沙壤土，pH值7.5～8.1，肥力中等。種植方式為單壟穴播，株距25 cm，行距75 cm，播深約12 cm，各材料均種植200 株。在植株生長期間，防雜草，并適時灌水、施肥，以滿足植株生長發(fā)育的需求。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉育性的觀測 在馬鈴薯的盛花期，隨機采集各材料盛開的花蕾帶回室內，用鑷子將花藥中的花粉均勻的抖落在載玻片上，滴1%醋酸洋紅染液，染色15 s，在10倍顯微鏡下觀察統(tǒng)計各材料可育和不可育花粉粒數(shù)，約150個視野。觀察標準：染色均勻且較深，內容物飽滿的花粉粒為可育花粉；染色不均勻且畸形、癟縮的花粉粒為不可育花粉?；ǚ劭捎?%)=(可育花粉粒總數(shù)/觀察的花粉?？倲?shù))×100%[9]。

1.2.2 PMCMⅠ(花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ)染色體配對行為觀測 在馬鈴薯的現(xiàn)蕾期，于8:30-11:00在田間采取各材料的幼小花蕾，立即放入裝有卡諾試液的試管中，帶回實驗室先放在4 ℃冰箱固定24 h，取出后用95%酒精洗滌2～3次，存放在70%酒精中，置4 ℃冰箱中備用[10-11]。制片時，用鑷子取一個花蕾放置在干凈的載玻片上，剝出花藥，擠出花粉母細胞，去除雜質后加一滴卡寶品紅試劑染色20 s，蓋上載玻片用鑷子輕敲、壓片。在Olympus BX51顯微鏡100倍下觀察并統(tǒng)計染色體數(shù)目，每個材料觀察細胞數(shù)約150個，選取染色體清晰的細胞拍照。

1.2.3 供試材料DNA提取及純度檢驗 在苗期每種材料隨機選取0.20 g嫩葉，用植物DNA試劑盒及說明步驟提取基因組DNA。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和UV-2401PC雙光束紫外分光光度計檢驗各供試材料的純度和濃度后，將DNA的濃度稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.4 SSR引物來源及合成 本試驗所用的35對引物從NCBI網(wǎng)站公布的馬鈴薯SSR特異性引物中選取，委托上海生工生物有限公司合成[13]。用新品系NNS-P 11、NNS-H 6及對照MIN-021的基因組DNA進行SSR適宜引物篩選出了條帶清晰、多態(tài)性好的SSR引物10對(表1)。

表1 SSR適宜引物名稱和堿基序列Tab.1 SSR suitable primers name and base sequence

1.2.5 PCR擴增體系與程序 SSR-PCR擴增反應總體積為20.0 μL，包括上下游引物(0.500 μmol/L)各0.7 μL，模板DNA 2.0 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，dNTPs(0.225 mmol/L)1.4 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 μL，13.1 μL的ddH2O。

擴增反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，5個循環(huán)；95 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min反應終止后，將擴增產物置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.6 供試材料PCR擴增產物的電泳檢測 將灌好的6% PAGE膠板靜止2 h后，在恒定功率70 W的電泳儀上預電泳30 min，點樣量5.2 μL，Marker 100 bp DNA Ladder 2.5 μL，電泳時間1.2 h。電泳結束后將膠板放入固定液(冰乙酸20 mL、無水乙醇200 mL、蒸餾水1 800 mL)中，在搖床上低速搖蕩20 min，用蒸餾水漂洗3 min，用AgNO3溶液于黑暗條件下銀染15 min后，蒸餾水速漂2次，再放入顯影液(30 g NaOH、2 L蒸餾水、10 mL甲醛)中輕輕搖晃直至條帶清晰，于通風處晾干后掃描并統(tǒng)計[14]。

1.2.7 SSR多態(tài)性位點統(tǒng)計 膠板上SSR等位基因多態(tài)性位點的統(tǒng)計采用0/1賦值法，有條帶計“1”，無條帶計“0”，生成“0”、“1”二元數(shù)據(jù)矩陣，計算多態(tài)性條帶位點百分率(Percentage of polymorphic bands，簡稱P)=(擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)目/擴增出的條帶總數(shù))×100%[15]。

2 結果與分析

2.1 供試材料花粉育性及PMCM Ⅰ染色體配對構型

2.1.1 各新品系及對照的花粉育性 各馬鈴薯新品系及對照的花粉育性結果如表2所示。對照品種MIN-021的花粉可育率為50.86%。各新品系花粉可育率變幅在39.95%～81.12%，其中新品系NNS-Y 40的花粉育性最低，為39.95%，<50.00%，宜作母本材料進一步雜交改良利用，其余材料的花粉育性均>50.00%，NNS-P 11、NNS-H 4、NNS-C 10的花粉育性較高分別為81.12%，77.94%，77.76%，其次是新品系NNS-H 6、NNS-L 9的花粉育性，分別為67.27%，69.71%，它們均可作為父本材料進一步雜交利用。

表2 各新品系及對照的花粉可育率觀測結果Tab.2 Observation results of the pollen fertility rate for the new strains and control sample

2.1.2 新品系及對照的細胞PMCMⅠ染色體配對構型分析 由圖1和表3可知，各供試材料花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)的染色體配對構型有一定差異。對照品種MIN-021的染色體構型為2n=4x=48=6.94Ⅰ+8.32Ⅱ+4.02Ⅲ+3.09Ⅳ，其中6個馬鈴薯新品系間的單價體頻率變幅為1.08～8.23，二價體頻率變幅為6.92～14.89，三價體頻率變幅為1.18～6.07，四價體頻率變幅為1.93～3.40。6個馬鈴薯新品系NNS-P 11、NNS-H 6、NNS-H 4、NNS-C 10、NNS-L 9和NNS-Y 40的染色體配對構型依次分別為2n=4x=48=1.08 Ⅰ+14.89 Ⅱ+1.18Ⅲ+3.40Ⅳ、2n=4x=48=2.35Ⅰ+11.96Ⅱ+3.59Ⅲ+2.74Ⅳ、2n=4x=48=2.10Ⅰ+14.21Ⅱ+1.35Ⅲ+3.02 Ⅳ、2n=4x=48=3.31Ⅰ+13.98Ⅱ+2.99Ⅲ+1.94 Ⅳ、2n=4x=48=3.45Ⅰ+12.94Ⅱ+2.81Ⅲ+2.56 Ⅳ和2n=4x=48=8.23 Ⅰ+6.92 Ⅱ+6.07 Ⅲ+1.93 Ⅳ。

表3 各新品系及對照PMCMⅠ染色體配對構型Tab.3 Chromosome configuration of the new strains and control sample at PMCMⅠ

2.2 馬鈴薯新品系及對照材料的SSR分析

2.2.1 供試材料基因組DNA的質量檢測 6個馬鈴薯新品系及對照品種的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，基因組DNA的電泳條帶清晰穩(wěn)定，無拖尾，表明提取的各試樣DNA純度高，符合SSR分子標記電泳分析的要求(圖2)。

2.2.2 供試材料基因組DNA的SSR指紋特征 利用篩選出的10對SSR適宜引物對各供試材料基因組DNA進行PCR擴增，結果見表4。10對引物擴增出的片段在280～380 bp，共擴增出清晰穩(wěn)定的SSR條帶105個，其中多態(tài)性條帶82個，每對引物擴增出5～13條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增出10.5個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為78.10%，表明這7個供試材料間的遺傳差異較大。其中引物S153擴增出的總條帶數(shù)與多態(tài)性條帶數(shù)最多，S170擴增出的總條帶數(shù)與多態(tài)性條帶數(shù)最少，多態(tài)性比率分別為81.25%，83.33%。

另外，用特異性引物S153進行PCR擴增建立了能明確區(qū)分6個馬鈴薯新品系及對照的SSR指紋圖(圖3)，為下一步新品種的育成登記和保護利用提供了可靠的分子依據(jù)。

表4 10對適宜引物對各供試馬鈴薯材料基因組DNA的SSR多態(tài)性擴增Tab.4 Amplification results of 10 pairs of appropriate primers for potato strains genome DNA

2.3 馬鈴薯品系及對照材料的遺傳距離和聚類分析

根據(jù)遺傳距離矩陣結果顯示表明(表5)，各供試材料的遺傳距離(GD)變幅為0.244 4～0.687 5，平均遺傳距離為0.480 0，這表明各供試材料間存在一定程度的遺傳差異。NNS-P 11與NNS-Y 40之間的遺傳距離最小，其GD值為0.244 4，其次為NNS-H 4與NNS-H 6，其GD值為0.313 4，再者為NNS-P 11與NNS-L 9，其GD值為0.333 3，而NNS-H 4與NNS-C 10之間的遺傳距離最大，其GD值為0.687 5，NNS-H 6與NNS-L 9的遺傳距離也相對較遠，其GD值為0.621 6。

表5 馬鈴薯各品系的遺傳距離矩陣Tab.5 Genetic distance matrix of the potato strains

利用篩選出的10對引物的0/1數(shù)值進行聚類，以GD值0.40為基準，將7個材料劃分為3類：NNS-P 11、NNS-L 9、NNS-Y 40和對照MIN-021為一類，呈偏父本遺傳(因它們的父本材料均為MIN-021)；新品系NNS-H 6和NNS-H 4為一類，而新品系NNS-C 10單獨為一類(圖4)。

3 討論與結論

在植物花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ(PMCM Ⅰ)，染色體配對過程較為復雜，常會受到某些基因不同程度的影響，如基因倒位或斷裂等變異，都會導致減數(shù)分裂出現(xiàn)異常，遺傳物質發(fā)生交換，最終產生遺傳物質不完整且大小不同的花粉粒，致使花粉敗育[16]。已有研究表明，在玉米[17]、大豆[18]、水稻[19]等作物上花粉敗育或育性低的主要原因是雜種F1的染色體組來自于不同親本，產生了配對不平衡現(xiàn)象，如較高頻率的單價體、多價體和落后染色體等導致的雜種F1不育，故在減數(shù)分裂過程中二價體的出現(xiàn)頻率越高，同源染色體進行正常聯(lián)會，其花粉育性就越高。本試驗對6個馬鈴薯新品系及對照材料PMCMⅠ的染色體配對構型和花粉育性觀測結果與前人在其他作物上的研究結果具有一致性，二價體出現(xiàn)頻率高的新品系，其花粉可育率亦相對較高，而單價體和多價體出現(xiàn)頻率高的新品系，其花粉可育率亦較低。如新品系NNS-Y 40的單價體和三價體頻率較高(8.23，6.07)，其花粉育性最低為39.95%，新品系NNS-P 11的二價體頻率最高(14.89)，花粉育性較高為81.12%，該研究結果為6個馬鈴薯新品系的育性鑒定和作為中間材料進一步利用提供了細胞遺傳學依據(jù)。

SSR標記是繼RAPD標記后以PCR反應為基礎的分子標記技術之一，因其呈共顯性遺傳，重復性好，多態(tài)性豐富[20]，已被廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、目的基因定位及分子標記輔助選擇育種等方面[21-23]。聚類分析則是按親緣關系將品種或品系進行分類，同一類品種或品系間遺傳距離小，相似程度高，不同類別的品種或品系間遺傳距離大，相似程度低。在雜交育種親本選配中應選擇親緣關系遠、遺傳差異大的品種。聚類分析模型可直觀、簡明的顯示出各材料間的親緣關系，增加雜交育種的成功率。張招娟等[24]利用22對SSR引物對19個馬鈴薯品種進行遺傳多樣性分析，其多態(tài)性高達96.6%。李芳弟等[25]利用篩選出10對重復性好的SSR引物對227份加工型馬鈴薯實生群體進行UPGMA聚類分析，將其分為2大類。本試驗選用的10對SSR適宜引物對6個馬鈴薯新品系及對照材料的基因組DNA進行PCR擴增得到82個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為78.10%，說明各材料間有較大的遺傳差異。聚類結果顯示，以GD值0.40為基準，將7個馬鈴薯材料分為3類，NNS-P 11、NNS-L 9、NNS-Y 40與對照MIN-021為一類，表明這4個供試材料間親緣關系較近，而新品系NNS-H 6和NNS-H 4為一類，新品系NNS-C 10單獨為另一類，表明兩者間存在著一定程度的差異性。另外，利用篩選出的1對特異性引物S153成功地建立了各供試材料的SSR指紋圖，可將7份馬鈴薯材料很好地區(qū)分開來。上述結果充分驗證了SSR標記技術用于馬鈴薯新品系鑒定和多態(tài)性分析是可行的，這為6個馬鈴薯新品系的育成登記及利用提供了可靠的分子依據(jù)。