劉 丹，梁 丹，王從磊，時曉偉，許慶芬，高 楊，候康波，張 欣，馮 剛，王建賀

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)作物研究所，天津市農(nóng)作物遺傳育種重點實驗室，天津 300384；2.唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000)

我國是世界上最大的小麥生產(chǎn)國，也是最大的消費國，小麥生產(chǎn)在保障國家糧食安全和提升居民生活水平中具有舉足輕重的地位[1-2]。隨著科學技術的發(fā)展，小麥遺傳育種研究取得了豐碩的成果，向著優(yōu)質(zhì)、抗病、高產(chǎn)、廣適的方向發(fā)展[3]。同時，每年有大量的小麥良種進入銷售市場，隨之而來的種子質(zhì)量問題成為市場和種子企業(yè)關注的重要問題，例如發(fā)芽率、凈度及種子純度等指標。其中，種子純度鑒定是種子生產(chǎn)企業(yè)必需具備的檢驗技術，因此，如何快速、高效、準確的鑒定種子純度，成為擺在育種家、種子銷售企業(yè)面前的重要課題。

目前，農(nóng)作物種子純度檢驗方法為國標GB/T 3543.5-1995，主要包括外觀鑒定和生理生化鑒定。隨著分子時代的到來也出現(xiàn)了DNA水平上的“分子鑒定”。外觀鑒定簡單、經(jīng)濟、快速，但準確性較差，且不同品種間種子外觀形態(tài)的差異越來越小，因此，靠區(qū)別種子形態(tài)上的差異來鑒定種子純度可靠性較低[4]。DNA鑒定沒有器官的特異性，不受環(huán)境的影響，有較高的準確性、穩(wěn)定性和重復性。該技術靈敏度高、快速、多態(tài)性強、DNA的用量少、具有較好的重復性[5]。但是DNA鑒定需要育苗提取DNA、用特異引物進行PCR檢測及電泳等過程，需要進行數(shù)以千計的引物設計篩選[6-7]。且上述方法均只能鑒定當代種子純度，不能鑒定下一代種子的純度，而商業(yè)化育種是要鑒定下一代種子純度，確保農(nóng)民種植不出問題，確保糧食安全。

醇溶蛋白在多種作物的籽粒中均有表達，同時其具有品種間多態(tài)性，被稱為植物的“指紋”[8-10]。在麥類作物中，醇溶蛋白的積累幾乎不受環(huán)境因素的影響，而且具有品種間異質(zhì)性，因此，可通過醇溶蛋白的多態(tài)性進行品種的純度鑒定[11]。1986年國際種子檢驗協(xié)會(ISTA)頒布了用于小麥、大麥品種鑒定的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)標準程序，用于檢測作物的純度及親緣關系。

研究表明，不同大麥品種的谷蛋白和醇溶蛋白在不同品種間存在總量、各個組分的含量的多態(tài)性，可以為群體結(jié)構(gòu)劃分和純度鑒定提供可靠數(shù)據(jù)支撐[12-14]。同時，谷子醇溶蛋白的研究也表明，不同材料間，谷子醇溶蛋白的多態(tài)性明顯，說明醇溶蛋白也可作為谷子不同品種的“指紋”[15]。醇溶蛋白在小麥不同品種、材料中具有廣泛的等位變異，影響醇溶蛋白積累的QTL位點分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、6A、6B、7A、7B上[16-17]。換言之，影響和參與小麥醇溶蛋白積累的基因在染色體上均有分布，這也是小麥醇溶蛋白可作為“小麥指紋”的重要原因之一。

本研究中，通過標記不同小麥品種開花日期，提取開花后不同天數(shù)的小麥籽粒醇溶蛋白，明確醇溶蛋白的積累模式，找到小麥籽?？梢赃M行醇溶蛋白鑒定的最早籽粒發(fā)育時間，實現(xiàn)收獲前的純度鑒定，為鑒定種子純度提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為濟麥31、津強11號、津強13號，種植于天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物研究所實驗田，試驗材料由天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物研究所保存。

1.2 試驗方法

對小麥開花日期進行標記，收取濟麥31、津強11號、津強13號開花后5，10，15，20，25，30，35 d[18]籽粒，自然風干，備用。

小麥育種基地，隨機選取來自不同小麥株的185個穗子，置于烘箱，60 ℃烘干，脫粒，每穗檢測1粒種子。由實驗員隨機插入25粒不同小麥品種的籽粒(包含津強11號)，由另外的實驗員進行醇溶蛋白提取及檢測與雜株分析，分析后與最初實驗人員進行核對，剔除混入雜株后，計算鑒定種子純度，以確保試驗準確性。

使用研缽將收獲的籽粒研磨成粉末狀，進行醇溶蛋白的提取。將粉末放置于2.0 mL離心管，向每個樣品即離心管中加入200 μL蛋白提取液(70%乙醇，20%蔗糖)，蓋好蓋子，置于搖床，100 r/min振蕩提取2 h。取出上步中的離心管，加入150 μL A-PAGE上樣緩沖液，80 mL丙三醇，0.02 g甲基綠，20 mL去離子水，上下顛倒混勻，常溫離心10 min (轉(zhuǎn)速12 000 r/min)。進行A-PAGE凝膠電泳檢測[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒不同發(fā)育階段醇溶蛋白表達分析

對濟麥31、津強11號、津強13號小麥進行開花標記，提取小麥不同發(fā)育階段籽粒的醇溶蛋白，分別對開花后5，10，15，20，25，30，35 d和完全成熟的小麥籽粒醇溶蛋白進行A-PAGE電泳。發(fā)現(xiàn)小麥開花后5，10 d時醇溶蛋白電泳圖譜沒有清晰明顯的條帶，此時籽粒醇溶蛋白的含量幾乎為零；濟麥31 15 d時開始出現(xiàn)條帶，津強11號未見明顯條帶，津強13號條帶明顯；開花后20 d，3個品種的條帶基本穩(wěn)定，并與完全成熟籽?；疽恢?圖1)。

2.2 津強11號純度鑒定

津強11號取株高約75 cm，籽粒紅色，田間長勢基本一致(圖2)。對津強11號收獲前的材料進行醇溶蛋白單粒鑒定，在第1個重復中發(fā)現(xiàn)14個與

津強11號帶譜不一致的電泳孔道，認為是雜株；在第2個重復中發(fā)現(xiàn)14個與津強11號帶譜不一致的電泳孔道，認為是雜株；在第3個重復中發(fā)現(xiàn)13個與津強11號帶譜不一致的電泳孔道，認為是雜株(圖3)。

插入的籽粒位于第1，23，27，32，37，42，48，70，82，88，96，100，122，126，134，138，145，148，161，174，177，181，185，188，210孔道(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與電泳檢測結(jié)果位置吻合。實驗員隨機插入25粒，檢測出25粒，吻合度為100%。

2.3 純度鑒定分析

統(tǒng)計分析表明，去掉人為插入雜株后，第1個重復共檢測63株，其中雜株7株，純度為88.89%；第2重復檢測62株，其中雜株6株，純度為90.32%；第3重復檢測61株，其中雜株4株，純度為93.44%。本試驗田津強11號平均純度為90.88%(圖4)。

表1 津強11號醇溶蛋白品種純度鑒定插入品種及位置Tab.1 The insert variety and location in seed quality testing based on gliadin bands of Jinqiang 11

3 討論

為了簡化良種繁育過程中種子純度鑒定費時、成本高等困境，本研究通過研究醇溶蛋白表達模式，明確可鑒定醇溶蛋白的最早發(fā)育時期，從而在收獲前實現(xiàn)種子純度鑒定。

前人研究表明，編碼麥谷蛋白和醇溶蛋白的基因主要在開花后的10～20 d表達，且不同基因組的表達量及表達模式略有差異[21]。編碼α/β醇溶蛋白的基因主要在開花后10 d達到表達高峰，隨后表達量逐漸下降[22-23]。編碼γ型的醇溶蛋白的基因在不同品種間存在差異，如在中國春(Chinese Spring, CS)及中國春的1B染色體代換系(CS-1S1)呈現(xiàn)了不同的表達模式。在CS-1S1中編碼γ型的醇溶蛋白的基因從開花后第5天開始表達，開花后10 d表達量迅速上升，在開花后第15天表達出現(xiàn)峰值，而中國春中編碼γ型的醇溶蛋白的基因在開花后第10天就達到了表達峰值[24-26]?？傊?，醇溶蛋白編碼基因組高豐度表達，主要集中的開花后的10～20 d。

開花后5，10，15，20，25，30，35 d到完全成熟的小麥籽粒提取醇溶蛋白發(fā)現(xiàn)，開花后10 d內(nèi)的籽粒，均未檢測到醇溶蛋白條帶，說明醇溶蛋白在開花前期并未大量積累，與基因表達模式相吻合。濟麥31開花后第15天出現(xiàn)醇溶蛋白條帶，但條帶較弱；津強11號在開花后第20天出現(xiàn)可見條帶，津強13號在開花后第15天即可出現(xiàn)較明顯的醇溶蛋白條帶，說明不同品種醇溶蛋白積累速度存在一定差異，但是均呈現(xiàn)出開花后20～25 d可檢出明顯、完整條帶，因此，可在小麥開花后第20～25天至收獲前均可進行醇溶蛋白鑒定，完成純度檢測。

目前，DNA指紋純度檢測方法對于種子企業(yè)而言存在時間長、工作量大、成本高等諸多問題。同時，單純依靠外觀鑒定種子純度具有不確定性和風險性，通過對小麥開花后醇溶蛋白的鑒定，能夠提早準確的鑒定良種田的種子純度，為良種繁育企業(yè)提供一套新的種子純度檢測技術。