耿鑫鑫，于麗杰，陳 超，金曉霞

(哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，“植物生物學”黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150025)

近年來，我國受到鎘(Cd)、鉛(Pb)、銅(Cu)等重金屬污染面積較廣。Cd是一種劇毒重金屬，是生物非必要元素之一，被國際癌癥研究中心(IARC)等國際組織列為環(huán)境風險首要控制元素之一[1]。Cd作為土壤重金屬主要污染控制元素之一，具有較強的毒性，植物根系最先受到重金屬毒害而表現(xiàn)為根系生長緩慢、根系發(fā)黑等[2-4]；同時，干旱、鹽堿和高溫等其他非生物脅迫因素也嚴重影響植物的生長發(fā)育，引起一系列生理生化變化，嚴重時容易導致植物的整株死亡，這對農業(yè)生產產生了極大影響[5]。干旱是影響植物性狀的顯著影響因子之一，干旱脅迫對葉相對含水量、葉綠素含量等性狀都會產生顯著影響[6-8]；鹽脅迫能夠破壞土壤結構，使植物爛根、萎蔫、生長受阻等[9-10]。

糖基轉移酶不僅是多糖合成的關鍵酶，同時也是催化糖基反應的酶，在非生物脅迫下能夠起到重要的作用，通過一系列蛋白修飾參與到植物抵抗非生物脅迫反應中[11-12]，這些非生物脅迫主要包括干旱、鹽、高溫等。例如，擬南芥UGT75X能夠在干旱、鹽脅迫下上調表達[13]，擬南芥UGT-LIKE基因在375 mmol/L甘露醇和150 mmol/L NaCl處理下該基因的表達量也明顯升高[14]，玉米次生代謝糖基轉移酶UFGT2通過黃酮醇修飾能夠提高植物對非生物脅迫的耐受性[15]。一直以來，對糖基轉移酶的研究主要以擬南芥為材料，揭示出它們在植物生命周期中扮演不同的角色[16-17]。

本試驗前期通過高通量測序分析篩選獲得一個UDP-糖基轉移酶基因，番茄鎘脅迫下該基因的表達量顯著升高，即其參與番茄鎘脅迫應答反應，但還需進一步對該基因如何參與番茄鎘或其他非生物脅迫反應進行深入研究。UDP-糖基轉移酶與植物關系較為親密[18]，能催化多種底物并通過糖基轉移酶的糖基化作用來參與植物對非生物脅迫的適應[19-20]。擬南芥UGT85A5基因屬于UDPGT超基因家族，在煙草中的外源表達顯著提高了煙草對鹽脅迫的適應能力[21]；花生中克隆AhUGT83A1-like的UDP-葡萄糖基轉移酶的基因顯示了參與花生對干旱、低溫和高鹽抗性的調控[22]；目前，有關UDP-糖基轉移酶的研究主要集中在擬南芥、大豆等植物對干旱、鹽脅迫下的表達[23-25]，但是研究番茄在非生物脅迫下的表達，特別是對于重金屬脅迫的研究較少，而番茄作為世界重要的園藝作物之一，研究其抗逆機理尤為重要。

本試驗以番茄(Lycopersicon esculentumMill.)為試驗材料，通過克隆得到UDP-糖基轉移酶基因，命名為SlUDP基因，利用生物信息學對其氨基酸序列及系統(tǒng)進化樹等進行預測，并通過熒光定量PCR分析該基因在不同組織中的表達特性以及在鎘脅迫下番茄根和葉的表達量變化，進一步利用酵母表達系統(tǒng)對SlUDP基因進行轉基因酵母功能驗證，探究該基因在3種不同非生物脅迫條件下(鎘、干旱和鹽脅迫)的表達特征，為糖基轉移酶基因SlUDP的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的植物材料為番茄常規(guī)商品種紅羅成，根據(jù)植物分子生物學實驗室前期的材料篩選，為鎘敏感型番茄品種。提取四葉期的番茄根和葉的總RNA，合成番茄總cDNA，用于克隆待用。用50 μmol/L CdCl2對四葉期的番茄苗進行處理，分別在處理后0，1，2，3，4與5 d，剪取根部和葉片各0.1 g，放入-80 ℃冰箱保存，用于表達分析。

菌株材料由上海唯地生物和中宜生物公司提供的酵母感受態(tài)INVSC1和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。

1.2 試驗方法

1.2.1SlUDP基因的克隆SlUDP通過NCBI中Blast在線查找，GenBank登錄號為XM-004249181.3，通過Primer 5.0軟件設計SlUDP基因的特異性引物(表1)。試驗首先提取番茄葉片總RNA(RNA提取試劑盒由康為世紀公司提供)。反轉錄合成番茄cDNA。以其為模板，通過PCR擴增得到SlUDP基因cDNA序列，PCR反應體系為9.5 μL ddH2O、1 μLSlUDP-R (10 μmol/L)、1 μLSlUDP-F (10 μmol/L)、12.5 μL 10×PCR Buffer Mix、1 μL cDNA，共25 μL。PCR反應程序：94 ℃ 8 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分離，用OMEGA Gel Extraction kit凝膠回收試劑盒(OMEGA公司)進行PCR產物純化。純化產物克隆入pGM-T (天根公司)，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，采用質粒小提試劑盒(康為世紀公司)提取質粒，經雙酶切進一步驗證后，送上海生工公司測序。

表1 PCR特異性引物序列Tab.1 PCR specific primer sequences

1.2.2SlUDP基因生物信息學分析 根據(jù)SlUDP的基因序列，通過NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站進行在線比對；使用ClustalW多重比對軟件對氨基酸序列的同源關系進行分析，以及在Neighbor-joining的基礎上構建系統(tǒng)進化樹；通過Psipred軟件對氨基酸二級結構進行預測；通過ORF Finder 分析預測開放閱讀框。

1.2.3SlUDP基因的組織表達特性分析 取生長90 d的同一植株番茄葉、根、主莖、側莖、花、果實各0.1 g(各組織部位設置3次生物學重復)，放入液氮速凍，提取RNA，反轉錄為cDNA，內參為β-Actin，采用熒光定量PCR進行定量分析，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 鎘脅迫下SlUDP基因的表達處理 對3-4葉期番茄幼苗的根和葉用CdCl2(50 μmol/L)處理。每個時間點3次生物學重復，材料放入液氮速凍后于-80 ℃保存待用。提取根和葉的RNA，反轉錄為cDNA。用Primer 5.0設計所需引物，番茄的內參基因為β-Actin。使用熒光定量PCR進行定量分析，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.5SlUDP基因酵母過表達載體的構建 將pGM-T-SlUDP質粒經XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切后，回收片段；酵母表達載體pYES2以XbaⅠ、KpnⅠ切開，將回收的片段與之連接，構建重組質粒pYES2-SlUDP，重組質粒及pYES2空載體分別轉化酵母INVSC1感受態(tài)中，篩選出陽性克隆送樣測序。酶切、連接、轉化、篩選和鑒定等步驟均按常規(guī)分子克隆方法進行。

1.2.6 轉SlUDP基因酵母非生物脅迫處理 從酵母pYES2-SlUDP和pYES2轉化子中分別挑取單個克隆于SC-U液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖)中培養(yǎng)。30 ℃培養(yǎng)16～20 h，5 000 r/min離心1 min，棄上清；5 mL SC-U誘導培養(yǎng)(2%半乳糖)重懸菌體，30 ℃誘導表達24 h，5 000 r/min離心1 min，0.9%NaCl重懸菌體，將菌液OD600調至一致到1.8。

固體培養(yǎng)基：10倍梯度稀釋，取2 μL點樣于非生物脅迫平板(Cd濃度為0，20，30 μmol/L；NaCl濃度為0，250，350 μmol/L)；PEG-6000(濃度為0，20%，25%)，30 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落生長情況，每組試驗設置3次重復。

液體培養(yǎng)基SC-U(2%葡萄糖)；取2 μL菌液接種于0.001 mL培養(yǎng)基中(脅迫條件同上)，30 ℃振蕩培養(yǎng)36 h，測定菌液OD600值，每組試驗設置3次重復，所得數(shù)據(jù)用SPSS 20進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 SlUDP基因生物信息學分析

2.1.1SlUDP基因的氨基酸序列比對 通過NCBI，檢索序列為番茄SlUDP基因的氨基酸序列，獲得在馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)、番茄(Lycopersicon esculentumMill.)、擬南芥(Arabidopsis thalialaL.Heynh)、水稻(Oryza sativaL.)等不同植物中的同源基因并進行氨基酸序列比對。結果如圖1，SlUDP與番茄、大豆、擬南芥等都有高度的一致性，因此說明SlUDP在多種植物中都有高保守性。

2.1.2SlUDP基因的二級結構預測 通過NCB1來查找SlUDP基因的開放閱讀框，其中所翻譯的蛋白質有483個氨基酸，編碼區(qū)長度為1 452 bp,結果如圖2所示。將克隆后的SlUDP序列經過生物信息學分析，用SOPMA對SlUDP的蛋白二級結構進行預測，在SlUDP的蛋白二級結構中，α-螺旋占比較高，約為43.06%，延伸鏈約為13.66%，β-轉角比例最少，約為5.8%。

2.1.3SlUDP基因的系統(tǒng)進化樹 根據(jù)同源性較高的氨基酸序列構建進化樹，通過親緣關系得到SlUDP和其他植物的同源關系。如圖3所示，馬鈴薯、花葉煙草、番茄、甜辣椒、石竹、紫椴為一支；擬南芥為一支；水稻、大豆、玉米為一支。SlUDP與甜辣椒的親緣關系最近，其次是馬鈴薯和花葉煙草，支持率達到98%，與玉米的同源關系最遠。

2.2 SlUDP基因的表達特性分析

取4月齡番茄的葉、根、主莖、側莖、花、果實探究SlUDP基因在這些組織中的表達特性。結果如圖4，可以看出，SlUDP基因在葉中的表達量是在主莖中表達量的8.4倍，表達量最顯著。其次在果實中的表達量是主莖中的5.8倍。根和側莖的表達量沒有顯著差異，大約是主莖的3倍。因此，可以看出SlUDP普遍存在于番茄各組織中且存在組織表達差異性，在葉片和果實中表達量較顯著，各部位的表達量趨勢是葉片>果實>根部>側莖>主莖>花。

2.3 鎘脅迫下SlUDP基因的表達分析

對四葉期番茄進行CdCl2處理，通過熒光定量對SlUDP進行表達量分析。結果如圖5所示，隨著時間增加，根和葉中SlUDP基因都能響應番茄鎘脅迫上調表達。在葉中，與0 d(對照)相比，2 d為對照的17.5倍，最大值為22.1，在5 h出現(xiàn)，上調表達后，除3 d有下降外，其他時間點變化較小。根中SlUDP基因3 d以前表達水平變化不大，4 d以后隨時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢，5 d上升量最為顯著，與0 d(對照)相比，為對照的6.2倍。

2.4 番茄SlUDP基因在3種非生物脅迫處理下酵母的表型分析

2.4.1 轉SlUDP基因在固體培養(yǎng)基下的酵母表型分析 將pYES2空載體和連接過的含有XbaⅠ、KpnⅠ酶切位點的轉SlUDP基因載體分別轉入酵母感受態(tài)INVSC1中，挑取pYES2-SlUDP和pYES2單菌落于SC-U選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h，后轉到誘導培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)1 d，將菌液濃度調到OD600=1.8后將稀釋倍數(shù)不同的菌液點到SC-U培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其生長情況。結果如圖6所示，正常生長情況下，重組酵母和對照酵母的生長無明顯差異。Cd處理濃度為30 μmol/L，當菌液濃度稀釋到105倍時重組酵母依然能存活而對照不能生長；利用20%，25%PEG-6000處理，20%處理下，重組酵母和對照酵母出現(xiàn)差異，25% PEG-6000處理下，差異更為顯著，稀釋104時對照酵母不再生長，重組酵母仍有部分存活；NaCl脅迫處理濃度為250，350 μmol/L，重組酵母和對照酵母隨著處理濃度的增加都大量死亡，沒有表現(xiàn)出顯著性差異。由此可見，SlUDP基因能夠提高轉基因酵母對鎘和干旱的耐受性。

2.4.2 轉SlUDP基因酵母存活率的測定 進一步對轉基因酵母的存活率進行測定，首先挑取酵母感受態(tài)細胞INVSC1的pYES2-SlUDP和pYES2單菌落搖菌，對OD600值進行測定，對酵母在Cd、干旱和鹽脅迫下進行定量分析。結果如圖7所示，隨著Cd脅迫濃度的增加，酵母OD600的值不斷降低，但pYES2-SlUDP一直高于pYES2，且從高濃度20%開始達到差異顯著性。隨著Cd脅迫濃度的增加，二者也呈現(xiàn)下降趨勢，且pYES2-SlUDP與pYES2相比菌液濃度始終較高，而在不同鹽脅迫下，轉基因酵母與對照相比存活率的差異不顯著。以上結果推測，SlUDP基因可以提高轉基因酵母在鎘和干旱脅迫下的存活率。

3 討論

番茄是一種世界性蔬菜，在重金屬脅迫下，番茄幼苗生物量、株高、葉綠素均隨處理重金屬質量比增大而降低[26]，干旱和高鹽等非生物脅迫能夠影響其萌發(fā)、生長發(fā)育和產量等[27]。因此，對參與番茄非生物脅迫調控的功能基因進行克隆與鑒定是番茄非生物脅迫研究中的重要組成部分[28]。

本研究從番茄中克隆出UDP-糖基轉移酶基因SlUDP。通過熒光定量PCR的分析可以看出SlUDP基因在番茄葉、根、主莖、側莖、花、果實中存在表達差異性，這與郭軍康[1]的研究結果中在番茄根、莖、葉中表達顯著一致，而顯著部位略有差異。重金屬鎘處理后通過熒光定量PCR分析結果表明SlUDP基因在葉和根中表達顯著，其研究表明SlUDP基因能響應重金屬鎘脅迫上調表達。本試驗通過酵母表達系統(tǒng)結果顯示SlUDP基因能響應干旱等非生物脅迫，這與張鳳菊[29]研究的糖基轉移酶UGT86A1，能夠參與干旱脅迫適應，在干旱脅迫下，UGT86A1過表達植株顯著上調一致，同時筆者推測SlUDP基因同樣能參與番茄抵抗干旱等非生物脅迫。

UDP-糖基轉移酶蛋白家族的作用機制和功能是多樣的，這是由于作用底物是多樣的。酵母表達體系具有較為完善的表達控制系統(tǒng)，能夠介導目的蛋白高度表達，由于生物功能進化上的保守性，使其可用于植物、動物、真菌等多種生物基因初步功能驗證[30]。通過過表達SlUDP基因于酵母中，觀察在固體培養(yǎng)基上菌落的生長，進一步測量液體培養(yǎng)基的OD值，對SlUDP基因在Cd、NaCl和干旱脅迫下的功能進行研究。結果顯示，在Cd和干旱脅迫下稀釋105倍時對照基本未見菌落生長，而pYES2-SlUDP重組酵母的生長情況較好。這說明SlUDP基因提高了酵母的耐鎘和耐干旱脅迫，但是沒有提高轉基因酵母耐高鹽脅迫能力。這與近年來研究的UGT75X[31]、UGT85A5[32]、UGT76C2[33]等均可提高植物耐旱機制一致。由此可見，在不同植物中UDP-糖基轉移酶表現(xiàn)相似，能積極響應非生物脅迫。綜上，本試驗在番茄中克隆得到SlUDP基因，通過熒光定量PCR分析該基因在不同組織中的表達以及在鎘脅迫下番茄根和葉的表達特征，最后利用酵母表達系統(tǒng)對SlUDP基因在鎘等3種非生物脅迫中的作用進行功能驗證，初步闡明了SlUDP基因在鎘、NaCl、干旱等方面的功能，為SlUDP基因家族參與抵抗番茄非生物脅迫提供理論依據(jù)。