李佳皓，謝敏秋，萬傳銀，左瑞潔，魯黎明，李立芹

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，四川 成都 611130；2.作物科學國家級實驗教學示范中心，四川 成都 611130)

TCP(TEOSINTE BRANCHED 1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR)轉(zhuǎn)錄因子由Cubas等[1]在1999年正式提出，該類型轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛存在。其中，Teosinte branched 1(TB1)基因最開始在玉米中發(fā)現(xiàn)，能抑制腋芽分生組織的生長并能促進雌性花序的形成[2-3]。Cycloidea(CYC)基因來源于金魚草，該基因控制著金魚草花的對稱性[4]。PROLIFERATING CELL FACTOR(PCF)是在水稻中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)PCF1和PCF2能結合水稻增殖細胞核抗原(PCNA)基因的啟動子，從而調(diào)控分生組織的特異性表達[5]。TCP轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類蛋白質(zhì)，在多細胞藻類中也有TCP蛋白的存在，僅在單細胞藻類中未發(fā)現(xiàn)[6]。TCP轉(zhuǎn)錄因子家族保守結構域是一個非典型的堿性氨基酸-螺旋-環(huán)-螺旋(basic-Helix-Loop-Helix, bHLH)結構，根據(jù)該結構域的差異可分為classⅠ和classⅡ 2個亞家族，classⅠ和classⅡ識別不同的順式作用元件site IIa (GGNCCCAC)和site IIb (GTGGNCCC)[1, 7]。

TCP轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育調(diào)控和環(huán)境信號應答的過程。在擬南芥和玉米中發(fā)現(xiàn)，與TB1s同源的AtBRC1(AtTCP18)和ZmTB1對分枝的形成表現(xiàn)為負調(diào)控作用，通過抑制腋芽分生組織的生長從而抑制分枝的形成[2, 8-9]。菊花CmTCP7基因?qū)貱YC類TCP轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)，該基因在菊花小花花芽分化時期和舌狀花花瓣中高表達，表明該基因可能參與形成兩側對稱的舌狀花[10]。水稻OsTB1是一個ZmTB1同源基因，研究發(fā)現(xiàn)在Ostb1突變體中水稻分蘗數(shù)增加，在過表達OsTB1水稻中分蘗數(shù)減少[11-12]。在金魚草和擬南芥中發(fā)現(xiàn)，一些TCP基因能抑制葉片生長，抑制這些基因的表達后出現(xiàn)葉片邊緣過渡生長而產(chǎn)生褶皺、鋸齒的表型[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子TCP14與TCP15參與GA3信號轉(zhuǎn)導過程，響應GA信號后激活相關基因的表達從而正向調(diào)控種子萌發(fā)[15]。此外，ⅰlhan等[16]在菜豆中鑒定出了27個TCP基因，并通過啟動子分析和熒光定量PCR技術發(fā)現(xiàn)，有10個菜豆Pvul-TCP基因表達受鹽脅迫調(diào)控。還有研究表明，轉(zhuǎn)BpTCP7基因能提高白樺的耐鹽堿能力[17]。綜上所述，TCP轉(zhuǎn)錄因子參與了植物分枝形成、花形態(tài)建成、葉片生長、種子萌發(fā)、逆境響應等過程。

目前，前人分析鑒定出了31個馬鈴薯TCP轉(zhuǎn)錄因子成員，發(fā)現(xiàn)在200 mmol/L NaCl脅迫條件下有6個StTCPs基因成員表達差異顯著，但其功能尚不明確[18]。因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用同源克隆的方法克隆出1個馬鈴薯TCP基因，根據(jù)同源性將其命名為StTCP13，實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)測定該基因的表達模式，并構建原核表達載體，在大腸桿菌中表達融合蛋白，通過觀察大腸桿菌在不同濃度NaCl鹽脅迫條件下的生長表型，初步探究該基因的功能。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試材料為馬鈴薯品種費烏瑞它(Solanum tuberosumL. Favorita)，無菌苗由四川農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯研究與開發(fā)中心提供。取(21±1) ℃光照培養(yǎng)箱(16 h光/8 h暗)中培養(yǎng)30 d的費烏瑞它無菌苗，整株液氮速凍后于-80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.1.2 主要試劑 DNA凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、TRIzol、2×TaqPCR Master Mix、感受態(tài)大腸桿菌DH5α和BL21等購自天根公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、cDNA合成試劑盒、克隆載體pMD19-T等購自TaKaRa；DNA Marker、蛋白Marker、Loading Buffer等購自Solarbio；原核表達載體pGEX-6P-1由本實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯StTCP13基因克隆 采用同源克隆法，參考NCBI收錄的馬鈴薯(S. tuberosum)TCP13基因CDS序列，登錄號為XM_006365599.2，設計基因5′端為BamH Ⅰ、3′端為XhoⅠ 酶切位點，Primer 5.0軟件設計引物(5′-3′)為：F-CGGGGATCCATGATA CAAAAGATGATTACTAGAGAAG;R-CGGCTCGAGCT AATTATGTGGATTGAAAAAATATTGT。PCR擴增程序為95 ℃預變性3 min; 95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán); 72 ℃延伸2 min 30 s，12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，目的片段純化回收后連接T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌落PCR法篩選陽性單克隆送至生工生物測序。

1.2.2 馬鈴薯StTCP13蛋白結構域分析與系統(tǒng)進化樹 采用DNAMAN軟件進行氨基酸序列分析與同源性比對，NCBI 數(shù)據(jù)庫的CDD軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)分析結構域，MEGA10和iTOL軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 馬鈴薯StTCP13基因的表達模式分析 取樣費烏瑞它原原種愈傷后的頂芽芽眼、常溫(16±2)℃儲藏至發(fā)芽芽長為2 mm的頂芽，以及出苗后30 d植株的根、直立莖、葉片進行取樣，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。TRIzol法提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR測定其相對表達量。從數(shù)據(jù)庫Spud DB(http://potato.plantbiology.msu.edu/)獲得StTCP13基因在不同脅迫條件下的FPKM值，Excel整理、TBtool軟件分析作圖。

1.2.4 馬鈴薯StTCP13-pGEX6P1原核表達載體的構建 使用BamHⅠ和XhoⅠ 2種限制性內(nèi)切酶將目的片段從重組T載體上切下，并將pGEX-6P-1載體雙酶切線性化，分別純化回收后用T4連接酶將目的片段與6P-1載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，隨機挑選單克隆菌落擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定法篩選陽性單克隆送至生工生物測序。

1.2.5 馬鈴薯StTCP13-GST標簽融合蛋白的原核表達 提取StTCP13-pGEX6P1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，菌落PCR法篩選陽性單克隆。取1個新鮮的陽性單克隆接種于10 mL含氨芐抗性(Amp+)的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導劑誘導0，2，4，6 h，每次取樣1 mL菌液于4 ℃保存。樣品于12 000 r/min離心集菌1 min，加入80 μL PBS和20 μL 5×Loading Buffer混勻并煮沸8 min，再次12 000 r/min離心1 min，取上清進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.6 轉(zhuǎn)StTCP13大腸桿菌BL21鹽脅迫表型分析 設置陰性對照為轉(zhuǎn)pGEX-6P-1空載體大腸桿菌BL21，分別挑取陰性對照和轉(zhuǎn)StTCP13大腸桿菌BL21的1個新鮮單克隆，接種至5 mL含Amp+的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5。4 ℃低溫12 000 r/min離心1 min集菌，1 mL無菌超純水重懸洗滌，重復2次。用無菌超純水調(diào)OD600為0.03，稀釋倍數(shù)1×、10×、100×、1 000×、10 000×，分別取3 μL在空白對照和鹽脅迫處理培養(yǎng)基上點斑。鹽脅迫處理培養(yǎng)基為額外添加200，250 mmol/L NaCl的含Amp+LB培養(yǎng)基，空白對照為不額外添加NaCl的含Amp+LB培養(yǎng)基，設置3次重復。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8 h觀察表型。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StTCP13基因克隆

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結果見圖1。在500～750 bp，有單一清晰條帶。將該片段回收純化后連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR法鑒定陽性單克隆，隨機挑選3個陽性單克隆測序。單克隆測序結果一致，測序得到馬鈴薯StTCP13基因CDS全長669 bp。

2.2 馬鈴薯StTCP13蛋白結構域分析

馬鈴薯StTCP13蛋白結構域預測結果如圖2-A所示，在第39-105位氨基酸發(fā)現(xiàn)一個典型的TCP超家族結構域。玉米ZmTB1、水稻OsPCF1和OsPCF2是早期發(fā)現(xiàn)的TCP轉(zhuǎn)錄因子，從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取ZmTB1(NM_001382583.1)、OsPCF1(XM_015778101.2)、OsPCF2(XM_015792844.2)氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進行多序列比對，結果如圖2-B所示，StTCP13氨基酸序列存在一個非典型的bHLH結構，說明StTCP13可能編碼一個由222個氨基酸組成的TCP類蛋白。

2.3 馬鈴薯StTCP13蛋白系統(tǒng)進化樹構建

運用NCBI網(wǎng)站的BlastP程序，檢索StTCP13同源性的氨基酸序列，選擇相似度不同20個物種的氨基酸序列，MEGA10和iTOL軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖3。馬鈴薯StTCP13與潘那利番茄SpTCP13(XP_006365661.1)、甜椒CaTCP13(XP_016561903.1)、煙草NtTCP13(XP_016491074.1)等氨基酸序列相似度較高，與闊葉櫟QlTCP13(XP_030953332.1)、相思子ApTCP13(XP_027358156.1)等氨基酸序列相似度較低。結果表明，StTCP13氨基酸序列保守性與物種進化關系一致。

2.4 馬鈴薯StTCP13基因的表達模式分析

利用qRT-PCR技術測定StTCP13基因在馬鈴薯根、莖、葉、芽、芽眼各組織的相對表達量，結果采用-2ΔΔCt法計算，LSD法進行顯著性檢驗。組織表達模式見圖4-A，該基因主要在馬鈴薯的根、葉片和芽中表達，在根中的相對表達量最高、芽眼中相對表達量最低，在根中的表達量是莖中表達量的57.28倍、是芽眼中的224.93倍。整理Spud DB數(shù)據(jù)庫中StTCP13基因的FPKM值，對StTCP13基因的脅迫條件下的表達模式進行分析，結果如圖4-B。在150 mmol/L NaCl、50 μmol/L ABA、260 μmol/L甘露醇處理條件下，該基因相對表達量不同程度上調(diào)，甘露醇處理條件下表達上調(diào)顯著，說明StTCP13基因的表達受高鹽、ABA、干旱等非生物脅迫條件的誘導。

2.5 馬鈴薯StTCP13-pGEX6P1原核表達載體的構建

設計BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，將StTCP13連接到pGEX-6P-1原核表達載體上，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，雙酶切法鑒定陽性單克隆，結果如圖5所示，在500～750 bp處有單一條帶，將鑒定的陽性克隆送至測序，測序結果證明StTCP13-pGEX6P1原核表達載體正向構建成功。

2.6 馬鈴薯StTCP13-GST標簽融合蛋白的表達

將構建成功的重組StTCP13-pGEX6P1原核表達載體導入大腸桿菌BL21中，以IPTG(終濃度0.5 mmol/L)為誘導劑，誘導StTCP13-GST標簽融合蛋白表達，誘導0，2，4，6，8 h后取樣進行SDS-PAGE電泳，預測StTCP13-GST融合蛋白大小約為51 ku，檢測結果如圖6所示。誘導2 h后，檢測到StTCP13-GST融合蛋白的表達，且隨誘導時間的增加，目的蛋白表達量上升，結果表明在大腸桿菌BL21中誘導表達了StTCP13-GST融合蛋白，蛋白大小約為51 ku。

2.7 轉(zhuǎn)StTCP13大腸桿菌BL21鹽脅迫表型分析

鹽脅迫處理培養(yǎng)基為額外添加200，250 mmol/L NaCl的含Amp+LB培養(yǎng)基，空白對照為不額外添加NaCl的含Amp+LB培養(yǎng)基，陰性對照為轉(zhuǎn)pGEX-6P-1空載體大腸桿菌BL21，調(diào)OD600為0.03后稀釋倍數(shù)1×，10×，100×，1 000×，10 000×，取3 μL在培養(yǎng)基上點斑，試驗設置3次重復，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8 h觀察表型。結果見圖7，LB+200 mmol/L NaCl和LB+250 mmol/L NaCl試驗組與對照組相比，表現(xiàn)為抑制大腸桿菌BL21生長，在LB+250 mmol/L NaCl條件下抑制更為明顯；在空白對照培養(yǎng)基上(圖7-A)，轉(zhuǎn)StTCP13大腸桿菌BL21與陰性對照的生長狀況無顯著差異；在LB+200 mmol/L NaCl和LB+250 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上(圖7-B、C)，隨稀釋倍數(shù)的增加，轉(zhuǎn)StTCP13大腸桿菌BL21表現(xiàn)為生長狀況要優(yōu)于對照組，當鹽濃度為250 mmol/L時，表型更為明顯。

3 討論

TCP是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物細胞分裂、影響分生組織的生長[1]。近年，隨著測序技術的發(fā)展，有更多植物的TCP轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來，在煙草中有61個[19]，辣椒30個[20]，高粱27個[21]，芥菜53個[22]，葡萄18個[23]。本研究從馬鈴薯費烏瑞它中克隆出一個TCP轉(zhuǎn)錄因子，依據(jù)同源性將其命名為StTCP13，該基因編碼區(qū)全長669 bp，與預測結果一致，可能編碼一個由222個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。TCP結構域為一個非典型的bHLH結構域，大約由60個氨基酸組成，根據(jù)該結構域的差異又分為classⅠ和classⅡ 2個亞家族，與classⅡ相比classⅠ的TCP結構域缺少了4個氨基酸[1,5,7]。蛋白結構域分析結果表明，StTCP13蛋白的第39-105位氨基酸為一個典型的TCP結構域，該結構域是TCP轉(zhuǎn)錄因子的重要功能域，識別并結合基因啟動子序列[5]。進一步分析其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該TCP結構域不存在4個氨基酸的缺失，說明StTCP13編碼蛋白為TCP轉(zhuǎn)錄因子超家族classⅡ亞族成員。系統(tǒng)進化樹分析結果表明，馬鈴薯StTCP13與潘那利番茄、甜椒、煙草等TCP13蛋白在同一進化分支上，說明TCP13蛋白在物種親緣關系上的保守性，同時也暗示了其功能相似性。

研究表明，番茄SlTCP7基因在根、莖、葉、花、果實等組織中均有表達，但表達豐度存在差異，該基因在番茄莖中表達量最高[24]。在對海島棉TCP轉(zhuǎn)錄因子的研究中發(fā)現(xiàn)，海島棉GbTCP14和GbTCP27基因存在組織表達特異性，在花瓣和花萼中表達量較高，并且在開花后5～20 d其表達量存在差異，該時期為棉纖維伸長分化的關鍵期，表明該基因與棉花纖維伸長分化有關[25-26]。還有研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯StBRC1a屬CYC/TB1類TCP轉(zhuǎn)錄因子，該基因在腋芽部位特異高表達，在純合突變體中植株表現(xiàn)為分枝增多的表型[27]。組織表達模式結果與前人研究一致，StTCP13基因具有組織表達特異性，在馬鈴薯根、莖、葉、芽、芽眼中的相對表達豐度有顯著差異，主要在根、葉片和芽中表達，而在塊莖愈傷后的芽眼中相對表達量極低，表明該基因可能與馬鈴薯根系、葉片和芽生長過程相關。TCP轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控植物生長和信號響應等多種生理生化過程，包括植物對非生物脅迫逆境的響應。在馬鈴薯TCP轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定中發(fā)現(xiàn)，200 mmol/L NaCl處理條件下StTCP20、StTC21等基因表達量顯著上調(diào)[18]。番茄SlTCP7基因在100 mmol/L NaCl處理3 h后，表達量顯著上升，隨后下降并維持在一個相對穩(wěn)定水平，表明該基因可能參與番茄鹽脅迫響應過程[24]。還有研究表明，大豆TCPs基因能響應熱、干旱、高鹽、ABA等非生物脅迫[28]。相關研究表明，TCP轉(zhuǎn)錄因子的表達與鹽脅迫等逆境有關，基于FPKM值分析馬鈴薯StTCP13脅迫表達模式發(fā)現(xiàn)，該基因可能響應高鹽、ABA、干旱等非生物脅迫。

為了進一步探究StTCP13基因響應鹽脅迫逆境的功能，本研究構建了StTCP13-GST標簽融合蛋白的pGEX-6P-1原核表達載體，將重組載體導入大腸桿菌BL21中，并成功誘導表達了StTCP13-GST融合蛋白。SDS-PAGE電泳結果表明，在誘導8 h后StTCP13蛋白表達量較高。轉(zhuǎn)StTCP13大腸桿菌BL21鹽脅迫表型分析結果表明，在LB+200 mmol/L NaCl和LB+250 mmol/L NaCl鹽脅迫條件下，大腸桿菌的生長受到一定抑制，而導入了StTCP13基因的大腸桿菌生長狀況要優(yōu)于對照，結果表明，高鹽脅迫可能誘導StTCP13的表達，其表達能一定程度上提高大腸桿菌對鹽脅迫的耐受性，說明StTCP13在響應鹽脅迫逆境中發(fā)揮一定功能。

從馬鈴薯品種費烏瑞它中克隆得到StTCP13基因，成功構建了StTCP13-GST標簽融合蛋白的pGEX-6P-1原核表達載體，并在大腸桿菌BL21誘導表達了目的蛋白。該基因CDS區(qū)全長669 bp，編碼由222個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，StTCP13-GST融合蛋白大小約為51 ku。蛋白結構域分析結果表明，StTCP13蛋白屬于TCP超家族中classⅡ亞族成員，系統(tǒng)進化樹表明StTCP13蛋白與潘那利番茄SpTCP13和甜椒CaTCP13同源性較高。表達分析結果顯示，馬鈴薯StTCP13基因在根中相對表達量最高，在芽眼中相對表達量最低，并且其表達受鹽脅迫誘導。轉(zhuǎn)StTCP13在一定程度上提高了大腸桿菌BL21對高鹽脅迫的耐受性。