賈利強，趙秋芳， 陳 曙

(1.貴州師范學院，貴州 貴陽 550018；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院，廣東 湛江 524091)

DOF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與植物生長發(fā)育等諸多生物過程，諸如生長代謝調(diào)控、植物激素反應、光周期形態(tài)建成以及逆境脅迫等諸多方面。一些研究表明，DOF蛋白可作為轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子在調(diào)控下游基因的表達方面發(fā)揮著作用[1]。第一個DOF基因是在玉米中發(fā)現(xiàn)的，在其基序中含有保守的DNA結合DOF結構域[2]。DOF結構域一般由50～52個氨基酸和含有4個半胱氨酸的鋅指結構構成, 這個保守的結構域可以特異的結合核心序列為5′-T/AAAG-3′的順式元件。DOF保守結構域一般位于DOF蛋白的N端, 和其他的調(diào)控蛋白結合形成復合體，共同調(diào)控下游基因的表達[3]。DOF基因在植物的生長發(fā)育進程中發(fā)揮著多方面的作用，諸如植物對逆境脅迫的防御[4-8]、種子儲藏蛋白的合成[9-10]、激素反應[11-12]、碳水化合物代謝[13]、葉片保衛(wèi)細胞的調(diào)控[14-15]、種子萌發(fā)[16-17]、光周期調(diào)控開花[18-19]等。

近些年來，DOF基因家族在不同植物中的分布進行了廣泛的研究。從低等單細胞藻類、苔蘚植物[20]到高等植物擬南芥和水稻[21]、大豆[22]、西紅柿[23]、玉米[24]、木薯[25]、蓖麻[9]、西瓜[5]等植物中進行了大量的研究。玉米是世界上最重要的作物之一，是糧經(jīng)飼綜合利用的大宗作物，為世界的糧食安全發(fā)揮著基石作用。有關DOF基因在玉米的生長發(fā)育進程中發(fā)揮的生物學功能報道的還不多。ZmDOF1是第一個發(fā)現(xiàn)的DOF基因，在花粉粒中有較高的表達水平[26]。同時玉米DOF1和DOF2參與調(diào)控一系列下游基因的表達，共同參與調(diào)控玉米碳氮代謝的平衡[27-28]。 逆境脅迫例如鹽或干旱脅迫是影響玉米生長以及產(chǎn)量的重要影響因子之一。植物也進化了一套精細的分子生理調(diào)節(jié)機制來適應逆境脅迫環(huán)境。本研究選用10個玉米DOF基因作為研究對象，利用定量PCR技術，分析了其在玉米不同組織中以及應答不同非生物脅迫條件下的表達模式，以期為進一步研究其生物學功能提供有價值的信息。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本研究中的系列試驗材料為玉米自交系B73，為了探測玉米ZmDOF基因在不同組織器官中的表達模式，B73自交系種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院玉米育種基地(廣東湛江)，生長至揚花授粉期，采集玉米的根系、莖、葉、雄花、授粉14 d的幼穗和苞葉等組織器官，液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱保存。對于脅迫試驗，B73的種子經(jīng)過5%次氯酸鈉溶液消毒后，置于黑暗環(huán)境下萌發(fā)，將發(fā)芽一致的種子轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)液中進行后續(xù)的各種試驗，營養(yǎng)液的配制以及各種脅迫處理試驗見前人的報告[29]。為了分析這10個基因?qū)ο鯌B(tài)氮或銨態(tài)氮饑餓的響應模式，將生長在含2 mmol/L KNO3或者NH4Cl營養(yǎng)液中生長14 d的玉米苗轉(zhuǎn)移到含0.02 mmol/L的KNO3或者NH4Cl營養(yǎng)液中，處理0，1，6，24 h后分別取玉米葉片，低氮冷凍，-80 ℃冰箱保存。為了分析10個ZmDOF基因應答干旱和鹽脅迫的響應表達模式，將生長14 d長勢一致的玉米苗轉(zhuǎn)移到20%的PEG6000溶液和200 mmol/L的NaCl溶液中，分別在0，1，6，24 h 分別取玉米葉片，低氮冷凍，-80 ℃冰箱保存。每個取樣時間點設置3個重復。

1.2 RNA提取與定量PCR

取0.1 g嫩葉組織，利用RNeasy FFPE Kit提取試劑盒(217004-50，GIAGEN，德國)提取組織總RNA，RNA濃度與純度用NanoDrop2000 (ThermoScientific, Massachusetts, 美國)進行測定。RNA提取的完整度用1% (m/V)瓊脂膠進行驗證。5 μg總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa Bio Inc., Otsu, 日本)進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。實時熒光定量PCR反應用的是羅氏LightCycler 480 實時定量 PCR儀以及2-ΔΔCT算法。采用Oligo7設計引物，玉米Actin引物用作內(nèi)參基因，引物序列見表1?；虻南鄬Ρ磉_水平用ZmDOF/Actin來表示。每個PCR數(shù)據(jù)重復4次并取其平均值。

表1 10個ZmDOF基因的實時熒光定量引物Tab.1 qRT-PCR primers for expression on analysis of ZmDOF

1.3 ZmDOFs鑒定、序列比對及進化樹分析

10個玉米DOF基因和蛋白序列及染色體位置等信息來自于Phytozome在線數(shù)據(jù)資源(https://jgi.doe.gov/data-and-tools/phytozome/)，擬南芥相關的信息來源于Tair在線數(shù)據(jù)資源(https://www.arabidopsis.org/)。對于進化樹分析，10個ZmDOF蛋白序列和36個擬南芥的AtDOFs蛋白序列構成一個數(shù)據(jù)矩陣，利用MAFFT在線軟件中的L-INS-i算法進行序列比對 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)，去除不保守的序列后，利用MEGA軟件中的NJ算法(http://www.magasoftware.net/)，參數(shù)設定為P-distance, Pairwise deletion of gaps, Bootstrap值設定為1 000，進行NJ進化樹的構建。

1.4 ZmDOFs染色體定位，基因結構及保守結構域分析

根據(jù)ZmDOFs基因在玉米基因組中的物理位置，用MapInspect軟件繪制ZmDOFs在染色體中的位置(http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html)。ZmDOFs的外顯子-內(nèi)含子基因結構通過比較cDNA序列與對應的基因組序列，利用在線網(wǎng)站GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)進行比對繪制。保守結構域分析利用在線軟件MEME分析(http://meme-suite.org/tools/meme)。

2 結果與分析

2.1 10個玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmDOFs的生物信息學分析

10個ZmDOF蛋白序列從Phytozome在線網(wǎng)站下載，其對應蛋白的長度為297(ZmDOF24)～420 aa (ZmDOF46)，預測的分子質(zhì)量和等電點分別為31.44(ZmDOF24)～42.10 ku(ZmDOF46)和4.57 (ZmDOF43)～9.63(ZmDOF13)(表2)。根據(jù)這10個DOF基因在染色體上的位置，利用軟件MapInspect軟件進行了染色體定位，結果顯示，這10個ZmDOF基因位于Chr1～Chr6以及Chr8和Chr10染色體上，其中Chr1, Chr2, Chr3, Chr6, Chr8和Chr10各有1個ZmDOF基因，Chr4和Chr5上各分布有2個ZmDOF基因 (圖1-A)。這10個ZmDOF蛋白序列的N端都包含保守的DOF結構域，由大約52個氨基酸組成的C2-C2鋅指結構構成(圖1-B)。通過比對這10個ZmDOF基因的CDS序列，繪制了基因結構，結果顯示，這10個ZmDOF基因沒有或只有一個內(nèi)含子，4個ZmDOF基因 (ZmDOF20、ZmDOF31、ZmDOF35和ZmDOF43)沒有內(nèi)含子，其余的只含有1個內(nèi)含子 (圖1-C)。進化樹分析結果表明，這10個ZmDOF基因分屬于不同的亞家族，亞家族Ⅰ包含ZmDOF23、ZmDOF31和ZmDOF463個基因，亞家族Ⅲ包含ZmDOF20、ZmDOF35和ZmDOF433個基因，亞家族Ⅳ包含有另外4個基因 (圖1-D)，表明這3個亞家族基因在玉米的歷史進化進程中很早就發(fā)生分離，其所發(fā)揮的生物學功能各異。

2.2 10個ZmDOF蛋白保守功能基序分析

利用在線的MEME軟件進行功能基序分析，共探測到6個保守的功能基序 (圖2-A)。其中Motif1預測為保守的DOF結構域，分布于全部的10個ZmDOF中。其他的功能基序散布于不同的蛋白中，8個ZmDOF蛋白含有Motif3基序，7個ZmDOF蛋白的N端含有Motif2基序，5個ZmDOF蛋白含有Motif5基序，3個ZmDOF蛋白含有Motif6，而ZmDOF24和ZmDOF33蛋白的C端分別含有Motif4基序(圖2-B)。

2.3 10個玉米DOF基因的組織表達分析

選取玉米B73楊花期的根部、莖部、成熟葉、雄花、授粉15 d的小穗和玉米苞葉為試驗材料，利用熒光定量PCR技術，探測了ZmDOF基因在這6個器官中的表達模式，結果表明，10個ZmDOF具有明顯的組織特異性表達模式 (圖3)。 其中7個基因(ZmDOF20、ZmDOF23、ZmDOF24、ZmDOF31、ZmDOF33、ZmDOF35和ZmDOF43)主要在揚花期的雄花中表達，與其他組織的表達量存在顯著差異，表明這7個基因可能參與玉米雄花的生長發(fā)育進程。ZmDOF31和ZmDOF33在雄花中的表達量是其他器官的1 000倍以上，表明這2個基因主要在玉米雄花中表達，可能參與玉米雄花的生長發(fā)育進程。ZmDOF20、ZmDOF24和ZmDOF35除了主要在雄花中表達外，還在玉米苞葉中表達，表明這3個基因可能參與玉米雄花和苞葉的生長發(fā)育。2個基因ZmDOF3和ZmDOF13主要在幼穗中表達，并且其表達量超過其他器官50倍以上，預示著這2個基因在玉米穗的生長發(fā)育進程中可能發(fā)揮作用。ZmDOF46主要在玉米的根系中表達，其在根部的表達量是其他器官表達量至少3倍以上。這些結果預示著這10個ZmDOF基因在玉米的生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的生物學功能。

2.4 10個ZmDOF基因?qū)EG6000和鹽脅迫響應分析

為了探測這10個ZmDOFs在干旱和鹽脅迫處理下的應答模式，為這10個基因的功能研究提供有用的信息，用20%的PEG6000和200 mmol/L的NaCl溶液模擬干旱和鹽脅迫處理，分別在脅迫處理的0, 1, 6，24 h取葉片，利用熒光定量PCR檢測了這10個基因的表達模式。結果表明，在不同脅迫處理1 h時，大部分基因的表達都發(fā)生了明顯的變化 (圖4)。在NaCl脅迫處理下1 h時，ZmDOF46的表達無顯著差異，表明ZmDOF46基因可能不參與玉米應答鹽脅迫信號途徑。ZmDOF3和ZmDOF13的表達下調(diào)，其中ZmDOF3表達下降了至少90%。ZmDOF23和ZmDOF31的表達在脅迫處理期間一直上調(diào)，其中ZmDOF31的表達上升了至少5倍以上。 在NaCl脅迫處理1 h時，有5個基因(ZmDOF20、ZmDOF24、ZmDOF33、ZmDOF35和ZmDOF43)的表達上調(diào)，與處理前相比存在顯著差異，其中ZmDOF43表達上調(diào)了至少10倍以上，之后這5個基因的表達量又恢復到原來的水平。這些結果表明，有9個ZmDOF基因在應答鹽脅迫時，其表達模式發(fā)生了改變，預示著這些基因參與調(diào)控玉米幼苗應答鹽脅迫響應途徑。在20%的PEG溶液整個脅迫處理期間，ZmDOF24的表達明顯下調(diào) (>90%)，而ZmDOF43在脅迫處理早期，其表達顯著下調(diào)(6 h)，之后又出現(xiàn)明顯的上調(diào)(24 h)。其他8個基因 (ZmDOF3、ZmDOF13、ZmDOF20、ZmDOF23、ZmDOF31、ZmDOF33、ZmDOF35和ZmDOF46)表達一直上調(diào)，而ZmDOF46的表達至少上升了10倍以上。這些數(shù)據(jù)表明，這10個ZmDOF基因的表達模式在干旱脅迫條件下發(fā)生了明顯的改變，預示著這10個基因可能參與玉米應答干旱脅迫響應機制，結果為后續(xù)的ZmDOF基因的生物學功能研究提供了有用的線索。

2.5 10個ZmDOF基因?qū)Σ煌螒B(tài)的響應分析

為了探測這10個基因?qū)ο鯌B(tài)氮或銨態(tài)氮脅迫的響應模式，生長至三葉期的玉米幼苗轉(zhuǎn)到硝態(tài)氮和銨態(tài)氮脅迫條件下，利用qPCR技術分析了這10個基因的表達模式(圖5)。 結果表明，在硝態(tài)氮或銨態(tài)氮脅迫處理下，大部分基因的表達都受到了不同程度的影響。在銨態(tài)氮脅迫處理下，有7個基因的表達發(fā)生明顯的上調(diào)，其中ZmDOF3上調(diào)的幅度超過5倍，表明這7個基因可能參與玉米幼苗應答銨態(tài)氮脅迫響應機制。在硝態(tài)氮脅迫處理下，這10個基因的表達都發(fā)生了明顯的改變。ZmDOF23和ZmDOF46的表達都受到了顯著的抑制，其表達量下調(diào)了至少90%。其他8個基因的表達在脅迫處理1 h時明顯的上調(diào)，其中ZmDOF3、ZmDOF13、ZmDOF20、ZmDOF24、ZmDOF35和ZmDOF43的表達量上調(diào)了至少10倍。其后隨著脅迫時間的延長，這些基因的表達量逐漸恢復到處理前的水平，甚至更低，表明這10個基因是玉米幼苗應答硝態(tài)氮脅迫的早期響應基因，可能參與玉米幼苗抵御硝態(tài)氮脅迫的響應途徑。這些結果表明，ZmDOF基因可能參與調(diào)控玉米幼苗不同氮形態(tài)的代謝平衡或應答不同氮形態(tài)脅迫響應機制。

3 討論與結論

已有研究表明，植物DOF基因家族在植物的生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的作用，諸如種子的生長發(fā)育、次生物質(zhì)的代謝、植物分蘗、維管束的形成和花的發(fā)育等?；诨虻谋磉_模式能為功能基因的研究提供有用的信息，利用qRT-PCR技術，探測了這10個基因在玉米6個不同器官組織的表達模式。ZmDOF3和ZmDOF13主要在玉米授粉15 d后的幼嫩的穗中表達，其表達量超過了其他器官50倍以上，表明這2個基因主要在玉米幼嫩的種子中表達。這一結果佐證了前人的研究結果[24],支持這2個基因的功能可能參與玉米幼胚、胚乳和種子的生長發(fā)育進程。已有諸多研究結果支持植物DOF基因家族在種子的生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的作用[30]。同時進化樹的結果表明，這2個基因聚合在一起 (Bootstrap=99%)，預示著在玉米的進化歷史事件進程中，這2個基因發(fā)生分離的時間不長，保留著類似的表達模式和生物學功能。在進化樹分析中，聚合在一起的同源基因具有共同的祖先，具有類似的基因和蛋白結構，呈現(xiàn)出相似的時空表達模式和保守的生物學功能。諸如亞家族Ⅰ中的ZmDOF23和ZmDOF31聚合在一起 (Bootstrap=99%)，它們的親緣關系比ZmDOF46要近，ZmDOF23和ZmDOF31的表達模式基本一致，主要在雄花中表達，而ZmDOF46主要在根部表達。亞家族Ⅱ中的3個基因也具有類似的結果,ZmDOF20和ZmDOF43聚合在一起(Bootstrap=99%),其表達模式類似，都主要在雄花中表達，而ZmDOF35除了在雄花表達以外，在苞葉以及幼嫩的穗中也表達。眾多植物DOF基因主要在植物的花器官中表達已有報道，表明植物DOF基因家族在花的生長發(fā)育進程中也發(fā)揮著重要的作用[31-32]。

非生物逆境脅迫諸如干旱和鹽等會嚴重地影響植物正常的光合作用，以及其他重要的代謝活動，比如氮素的代謝平衡等。挖掘及鑒定植物抗逆境脅迫的基因以及闡述其分子生理機理對于保持作物在逆境脅迫下的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，保障我國糧食安全顯得尤為重要。最近的研究結果表明，調(diào)控植物開花的DOF基因家族成員，CDFs的表達受到干旱和鹽脅迫的誘導。番茄基因組中編碼有5個CDFs基因，SICDF1-5，這些基因的表達受到干旱和鹽脅迫的強烈誘導，表明這些基因可能參與番茄抵御逆境脅迫的響應機制。在擬南芥中超表達這些基因，獲得的轉(zhuǎn)基因株系具有明顯的抗干旱和鹽脅迫的能力[31]。研究結果表明，大多數(shù)ZmDOFs基因的表達受到鹽或干旱脅迫的誘導或抑制，比如在鹽脅迫條件下，ZmDOF3的表達下降了90%，而ZmDOF31的表達至少上調(diào)了5倍，而在干旱脅迫條件下，ZmDOF24的表達下降90%，而ZmDOF46上調(diào)了至少10倍。研究結果預示著這10個ZmDOFs可能廣泛的參與調(diào)控植物應答鹽或干旱脅迫響應途徑，并且各個ZmDOF所發(fā)揮的生物學功能是不同的。

維持植物體內(nèi)氮素的代謝平衡對植物的生長發(fā)育至關重要。挖掘氮高效吸收利用的分子標記和基因資源，闡明其分子生理機制對于作物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，減少資源浪費和環(huán)境污染是十分必要的。已有報道玉米DOF1和DOF2基因的表達量與水稻、高粱和小麥的氮吸收效率以及產(chǎn)量呈正相關。在低氮脅迫環(huán)境下，ZmDOF1和ZmDOF2通過調(diào)控超表達ZmDOF1基因能顯著地促進這些作物的光合效率，提高氮素吸收，最終顯著的提高這些作物的產(chǎn)量[33]。在低氮環(huán)境下，ZmDOF1和ZmDOF2基因通過影響C4循環(huán)中的PEPC羧化酶基因的活性，從而影響植物的碳氮代謝平衡，增進植物對氮素的吸收，促進植物生長。小麥Tadof1基因的超量表達可促進谷氨酰胺合成酶和谷氨酸酶的表達，進而影響小麥氮利用效率[27]。ZmDOF1的同源基因，水稻OsDOF18基因具有類似的功能，通過調(diào)控氨氮的運輸和氮元素的分布，進而影響植物氮素的使用效率[28]。已報道的這些調(diào)控氮代謝平衡的基因都受到氨態(tài)氮脅迫的明顯誘導，而結果中只有ZmDOF3受到氨態(tài)氮脅迫誘導的幅度超過5倍。大部分ZmDOF基因的表達水平受到硝態(tài)氮脅迫的抑制，至少有6個基因的表達水平下降了至少90%。這些基因在維持玉米硝態(tài)氮代謝平衡時發(fā)揮的作用還有待進一步的研究。

鑒定了10個ZmDOFs, 并對其理化性質(zhì)、染色體定位、基因結構和蛋白功能結構域進行分析，利用qRT-PCR技術，檢測了這10個ZmDOFs在玉米不同組織中的表達模式，以及應答鹽、干旱、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮逆境脅迫條件下的表達響應模式，為后續(xù)研究ZmDOFs在玉米生長發(fā)育進程以及抵御非生物逆境脅迫的分子生理機制提供有價值的信息。