王中,張偉杰,劉雷,冷曉飛,高洪濤,江會(huì)杰,常亞青*
(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023; 2.大連海寶漁業(yè)有限公司,遼寧 大連 116045)
中間球海膽Strongylocentrotusintermedius又稱蝦夷馬糞海膽,原產(chǎn)于日本北方和俄羅斯遠(yuǎn)東沿海[1],其生長速度快、生殖腺顏色好、味道甜,是國內(nèi)外公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)海膽種類之一[2]。1989年中國從日本引入該種,隨后開展了其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、人工育苗及遺傳育種研究[1-2]。目前,該種已成為中國最主要的養(yǎng)殖海膽種類,其生殖腺年產(chǎn)量超過200 t[1]。近年來,中間球海膽?zhàn)B殖過程中不斷暴發(fā)黑嘴病、紅斑病和病變綜合征等各種細(xì)菌性疾病[3-7],且有日益嚴(yán)重的趨勢。細(xì)菌性疾病已成為威脅海膽?zhàn)B殖效益和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素,而如何有效防控疾病則成為中間球海膽?zhàn)B殖業(yè)最迫切需要解決的問題。
解析海膽對病原的免疫機(jī)理是開展其疾病防控的基礎(chǔ)。研究表明,無脊椎動(dòng)物對于疾病的免疫反應(yīng)較為原始,缺乏真正意義上的免疫抗體,只能依靠先天性的非特異性免疫系統(tǒng)來抵御外來病原體的侵染[8]。吞噬細(xì)胞構(gòu)成其免疫系統(tǒng)抵御外來病原體的第一道防線,其依靠吞噬作用對入侵的外源物質(zhì)進(jìn)行吞入和破壞[9]。吞噬作用在無脊椎水產(chǎn)動(dòng)物抗菌免疫中發(fā)揮重要作用,如蝦類血細(xì)胞在其免疫防御中通過識別、吞噬、包裹、結(jié)節(jié)形成排除異物[10]。貝類血細(xì)胞可以活躍地趨化到炎癥和損傷部位進(jìn)行吞噬,成為貝類免疫防御的主要細(xì)胞[11]。在海膽中,Yui等[12]研究發(fā)現(xiàn),紫球海膽S.purpuratus在6 h內(nèi)即可清除90%~99%進(jìn)入體腔液的細(xì)菌,同時(shí)體腔細(xì)胞數(shù)量下降90%以上;Ito等[13]研究發(fā)現(xiàn),光棘球海膽Mesocentrotusnudus的吞噬細(xì)胞可以有效識別并吞噬異種細(xì)胞,且體腔液中存在可增強(qiáng)吞噬功能的調(diào)理素;張穎[14]、李霞等[15]研究了溫度對健康中間球海膽吞噬能力影響,發(fā)現(xiàn)在25~30 ℃時(shí)吞噬細(xì)胞對酵母細(xì)胞的吞噬率最高;張穎等[16]發(fā)現(xiàn),裙帶菜凝集素可提高中間球海膽吞噬細(xì)胞的吞噬能力。上述均是對健康海膽吞噬細(xì)胞的吞噬能力進(jìn)行的研究。Zhang等[17-18]通過研究患紅斑病中間球海膽免疫基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),發(fā)現(xiàn)海膽患病后吞噬作用相關(guān)免疫通路基因表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢。從病菌入侵開始至海膽出現(xiàn)病癥期間,吞噬作用機(jī)制迄今尚未見報(bào)道,對此期間吞噬作用相關(guān)的免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測,有助于揭示海膽在病菌感染下的免疫或患病機(jī)理。
本研究中,用黑嘴病病原菌對中間球海膽進(jìn)行人工感染,并通過測量吞噬細(xì)胞及吞噬作用相關(guān)免疫因子隨感染時(shí)間的變化,解析中間球海膽對黑嘴病病原菌感染的免疫機(jī)理,以期為海膽疾病防控提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)用中間球海膽(殼徑約2 cm)108只隨機(jī)選自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工繁育群體。黑嘴病病原菌為本實(shí)驗(yàn)室分離純化并成功回感的菌種(待發(fā)表)。
1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將108只試驗(yàn)海膽平分放入6個(gè)10 L滅菌水槽中,每個(gè)水槽18只,暫養(yǎng)1 d后開始正式試驗(yàn)。試驗(yàn)開始時(shí),使用1 mL無菌注射器針頭從海膽圍口膜處刺入海膽體腔內(nèi),對海膽進(jìn)行損傷,之后向水槽中加入濃度為108CFU/mL的黑嘴病病原菌液10 μL,得到浸泡脅迫濃度為102CFU/mL(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明,使用該濃度感染,海膽在48 h后開始出現(xiàn)病癥)。分別在脅迫前(0 h)和脅迫后1、6、12、24、48 h取樣,取樣方法為:從6個(gè)水槽中各隨機(jī)取1只海膽,解剖后等量吸取體腔液1 mL,混勻后取100 μL用于體腔細(xì)胞分類計(jì)數(shù),另取900 μL用于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死檢測,剩余體腔液分裝至6個(gè)1.5 mL離心管中,4 ℃下以3 000g離心15 min,吸取上清液至1.5 mL離心管中并于-80 ℃保存,用于體腔液上清液中各免疫參數(shù)的測定,同時(shí)收集沉淀于-80 ℃下保存,用于體腔細(xì)胞中各免疫參數(shù)的測定。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)按同樣的方法取樣3次作為3個(gè)重復(fù)。
1.2.2 體腔細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 用血球計(jì)數(shù)板常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法,參考Smith等[19]的分類方法對體腔細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。
1.2.3 吞噬相關(guān)免疫參數(shù)測定 體腔細(xì)胞及體腔液上清液中酸性磷酸酶(ACP)活力、活性氧(ROS)含量、總抗氧化能力(T-AOC),以及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等免疫參數(shù)均采用碧云天生物技術(shù)(上海)有限公司相關(guān)試劑盒測定,所有檢測步驟均按照試劑盒說明書操作。
1.2.4 體腔細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取體腔細(xì)胞總RNA,用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,采用BiochromSimpliNano超微量分光光度計(jì)(英國Biochrom公司)檢測樣品RNA的純度和濃度,采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系(10 μL):5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL,Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL,Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL, Total RNA+RNase Free ddH2O 6.5 μL。樣品混勻后在 PCR 儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 條件為37 ℃下反應(yīng)15 min,85 ℃下反應(yīng)5 s, 4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 引物設(shè)計(jì)及RT-PCR 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18],篩選獲得中間球海膽補(bǔ)體C3前體(C3-pre)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶基因8(Caspase-8)和C型凝集素域家族成員4g(Clec4g)基因核心序列,采用Primer premier 5.0軟件對各基因設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1),引物于生工生物工程(上海)有限公司合成。
RT-PCR在LightCycler?96擴(kuò)增儀(Roche, 上海)上進(jìn)行,使用FastStart Essential DNA Green Master試劑盒(Roche,上海)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):FastStart Essential DNA Green Master(2×conc)10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 6.4 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃下預(yù)變性10 min;94 ℃下循環(huán)變性15 s,60 ℃下退火復(fù)性60 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法[20]分析各基因定量表達(dá)結(jié)果。
1.2.6 細(xì)胞的凋亡率和壞死率計(jì)算 以熒光顯微鏡下每個(gè)視野內(nèi)(每個(gè)樣品取3個(gè)視野)單種細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)除以該種細(xì)胞的總數(shù)計(jì)算得到該種細(xì)胞的凋亡率,單種細(xì)胞的壞死細(xì)胞數(shù)除以該種細(xì)胞的總數(shù)計(jì)算得到該種細(xì)胞的壞死率,并計(jì)算:
各免疫參數(shù)單細(xì)胞平均貢獻(xiàn)值=各免疫參數(shù)測量值/(吞噬細(xì)胞數(shù)-壞死細(xì)胞數(shù))。
試驗(yàn)采用SPSS 20.0軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù),采用單因素方差分析法分析黑嘴病病原菌脅迫對體腔細(xì)胞密度及各免疫參數(shù)的影響,采用LSD多重比較法分析不同時(shí)間點(diǎn)上各類細(xì)胞密度、各免疫參數(shù)平均值相對于0 h變化的差異性,顯著性水平設(shè)為0.05,極顯著水平設(shè)為0.01。
從表2可見:中間球海膽體腔液中變形吞噬細(xì)胞密度在脅迫前(0 h)為99.17×104cells/mL,在脅迫后1 h出現(xiàn)極顯著下降(P<0.01),且達(dá)到最低值23.89×104cells/mL,脅迫后6 h開始逐漸恢復(fù),至脅迫后24 h恢復(fù)至脅迫前水平(P>0.05),之后在48 h又出現(xiàn)極顯著性下降(P<0.01);無色桑椹細(xì)胞密度在脅迫前為12.50×104cells/mL,脅迫1 h后極顯著上升(P<0.01),6 h時(shí)達(dá)到最高值25.22×104cells/mL,之后開始逐漸下降,至48 h下降至脅迫前水平(P>0.05);脅迫后各時(shí)間點(diǎn)上纖毛游走細(xì)胞和紅色桑椹細(xì)胞的密度與脅迫前均無顯著性差異(P>0.05)。
表2 中間球海膽體腔細(xì)胞密度隨脅迫時(shí)間的變化
病原菌脅迫后吞噬細(xì)胞凋亡與壞死的顯微鏡觀察如圖1所示。從表3可見:中間球海膽體腔變形吞噬細(xì)胞凋亡率在病原菌脅迫后1 h呈極顯著上升(P<0.01),脅迫后6 h時(shí),凋亡率下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05),并保持至48 h;變形吞噬細(xì)胞壞死率在病原菌脅迫后1 h出現(xiàn)輕微下降,隨后開始上升,脅迫后12 h時(shí)極顯著升高(P<0.01),24 h時(shí)達(dá)到最高,之后開始下降,但48 h時(shí)仍極顯著高于脅迫前水平(P<0.01)。
A—纖毛游走細(xì)胞;B—紅色桑椹細(xì)胞;C—無色桑椹細(xì)胞;D—變形吞噬細(xì)胞;E—凋亡細(xì)胞;F—壞死細(xì)胞;G—正常細(xì)胞。A—vibratile cell; B—red spherule cell; C—colorless spherule cell; D—phagocytic amoebocyte; E—apoptotic cell; F—necrotic cell; G—normal cell.圖1 病原菌脅迫后吞噬細(xì)胞凋亡與壞死的熒光顯微鏡觀察Fig.1 Fluorescence microscope observation of apoptosis and necrosis of phagocytes in sea urchin exposed to pathogen stress
表3 吞噬細(xì)胞凋亡率與壞死率隨脅迫時(shí)間的變化
從表4可見:體腔細(xì)胞ACP酶活性在病原菌脅迫前0 h為114.99 U/L,在脅迫后總體上呈現(xiàn)下降趨勢,脅迫后24 h時(shí)下降約80%,達(dá)到最低值25.29 U/L,極顯著低于脅迫前(P<0.01),脅迫后48 h有所回升;體腔細(xì)胞內(nèi)活性氧含量在病原菌脅迫后6 h時(shí)達(dá)到最低值9.32×106,48 h時(shí)達(dá)到最高值12.40×106,但均與脅迫前無顯著性差異(P>0.05);體腔細(xì)胞總抗氧化能力在脅迫前為2.78 U/mg,脅迫后1 h時(shí)達(dá)到最高值3.49 U/mg,且極顯著高于脅迫前(P<0.01),6 h后逐漸下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05)。
從表4還可見:換算為單細(xì)胞平均貢獻(xiàn)值后,吞噬細(xì)胞ACP活性的單細(xì)胞貢獻(xiàn)值在病原菌脅迫前0 h為1.53×10-4U/L,脅迫后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,1 h時(shí)約上升至0 h時(shí)的3倍,達(dá)到最高值4.69×10-4U/L,極顯著高于脅迫前(P<0.01),12 h后逐漸下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05);活性氧含量單細(xì)胞貢獻(xiàn)值在病原菌脅迫后1 h時(shí)約上升至0 h時(shí)的6倍,達(dá)到最高值為76.77,24 h后下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05),48 h后又上升至與脅迫前有顯著性差異水平(P<0.05);總抗氧化能力單細(xì)胞貢獻(xiàn)值在病原菌脅迫前為0.37×10-5U/mg,脅迫后1 h時(shí)約上升至0 h時(shí)的7倍,達(dá)到最高值2.52×10-5U/mg,且極顯著高于脅迫前(P<0.01),12 h后雖有下降,但仍顯著高于脅迫前(P<0.05)。
表4 吞噬細(xì)胞中吞噬作用相關(guān)生理參數(shù)隨脅迫時(shí)間的變化Tab.4 Changes in phagocytosis related parameters in phagocytes with challenge time
從表5可見:體腔液上清液中ACP活性在病原菌脅迫前為0.80 U/L,脅迫后呈先上升后下降的趨勢,在1 h時(shí)達(dá)到最高值,為1.08 U/L,24 h時(shí)降到最低,但各時(shí)間點(diǎn)變化未達(dá)到顯著性水平(P>0.05);血清內(nèi)總抗氧化能力隨脅迫時(shí)間的變化呈先下降后上升的趨勢,在6 h時(shí)達(dá)到最低值,12 h后逐漸上升至與脅迫前相近水平,但各時(shí)間點(diǎn)的變化均未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。
表5 血清中吞噬作用相關(guān)生理參數(shù)隨脅迫時(shí)間的變化
以β-actin為內(nèi)參基因,用RT-PCR法檢測中間球海膽吞噬細(xì)胞中C3-pre、Caspase-8和Clec4g基因的相對表達(dá)量。從表6可見:總細(xì)胞中C3-pre基因相對表達(dá)量在脅迫后1 h時(shí)約上調(diào)至0 h時(shí)的4倍,且極顯著高于0 h(P<0.01),在之后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上出現(xiàn)下調(diào),但仍極顯著高于0 h(P<0.01);總細(xì)胞中Caspase-8基因相對表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào),在48 h時(shí)達(dá)到最高,約上調(diào)至0 h時(shí)的2倍,且極顯著高于0 h(P<0.01);總細(xì)胞中Clec4g基因相對表達(dá)量在脅迫后1 h時(shí)約上調(diào)至0 h時(shí)的7倍,且極顯著高于脅迫前(P<0.01),48 h時(shí)約上調(diào)至0 h時(shí)的4倍,其余各時(shí)間點(diǎn)均與0 h無顯著性差異(P>0.05)。
表6 吞噬細(xì)胞中吞噬作用相關(guān)基因相對表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的變化
海膽免疫系統(tǒng)的主要功能之一是吞噬作用,其介導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞是吞噬細(xì)胞,吞噬細(xì)胞可對外源粒子進(jìn)行搜索、捕捉和破壞[8]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在黑嘴病病原菌感染初期(1 h),吞噬細(xì)胞密度大幅下降,降幅達(dá)到80%,這說明當(dāng)外源病原菌入侵機(jī)體時(shí),機(jī)體通過吞噬細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)行防御,吞噬細(xì)胞殺死病原菌的同時(shí)自身消亡[17],這一結(jié)果與Yui等[12]觀察到紫球海膽在細(xì)菌注射1 h內(nèi)吞噬細(xì)胞密度下降80%的結(jié)果一致,不同之處是,紫球海膽其他3種體腔細(xì)胞也出現(xiàn)大幅下降,而本研究中其他3種體腔細(xì)胞未出現(xiàn)顯著下降,且無色桑椹細(xì)胞反而出現(xiàn)顯著升高,其原因尚待進(jìn)一步研究。吞噬細(xì)胞密度在后期(24 h)又基本恢復(fù)正常水平,說明機(jī)體重新生成了新的吞噬細(xì)胞以應(yīng)對剩余病原菌,趙新亞等[21]、Holm等[22]分別在中間球海膽和海星Asteriasrubens中檢測到LPS刺激后吞噬細(xì)胞密度的增加。在病原菌感染早期,細(xì)胞發(fā)生大量凋亡,細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動(dòng)消亡過程[23],說明在這一階段海膽利用細(xì)胞凋亡進(jìn)行主動(dòng)防御,在感染后期,細(xì)胞壞死率大幅上升,細(xì)胞壞死是細(xì)胞在致病因素作用下而發(fā)生的死亡[23],這說明海膽免疫系統(tǒng)吞噬作用的免疫能力面臨崩潰。
本研究中,從吞噬細(xì)胞密度、凋亡和壞死結(jié)果可推測出海膽在病原菌侵入后迅速利用吞噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬,并通過細(xì)胞凋亡進(jìn)行主動(dòng)防御,在6 h時(shí)雖然有新的吞噬細(xì)胞出現(xiàn)并參與防御,但是細(xì)胞凋亡率降低,細(xì)胞壞死率逐漸上升,說明機(jī)體免疫能力已下降,24 h時(shí)細(xì)胞壞死率達(dá)到最高,免疫系統(tǒng)逐漸崩潰導(dǎo)致海膽患病。
由于吞噬細(xì)胞發(fā)生大規(guī)模的凋亡和壞死,本研究中測量體腔細(xì)胞酶活等參數(shù)后,將其計(jì)算為單個(gè)正常吞噬細(xì)胞的平均貢獻(xiàn)值,這一指標(biāo)剔除了壞死細(xì)胞的干擾,更能準(zhǔn)確反映海膽的免疫狀態(tài)。對比結(jié)果顯示,體腔細(xì)胞中ACP、ROS和T-AOC呈現(xiàn)出不同的變化趨勢,而計(jì)算為單個(gè)吞噬細(xì)胞貢獻(xiàn)平均值后,這些指標(biāo)均一致呈現(xiàn)先升高后下降趨勢,這證明了單細(xì)胞貢獻(xiàn)平均值能更好地揭示海膽吞噬作用相關(guān)免疫反應(yīng)的規(guī)律。在病原菌脅迫后早期,單細(xì)胞ACP較脅迫前上升,這說明在吞噬作用中,細(xì)胞釋放了大量的ACP[24],用于殺滅病菌,這在早期免疫應(yīng)答中可能起到重要作用,這與細(xì)菌感染后的櫛孔扇貝[25]、刺參[26]等ACP活性變化相一致。本研究中,單細(xì)胞ROS和T-AOC在病原菌感染后分別上升了約6倍和7倍,這種變化趨勢與受到脅迫后的櫛孔扇貝[27]和長牡蠣[11]相一致,這說明海膽在感染后通過伴隨吞噬作用的呼吸暴發(fā)產(chǎn)生大量活性氧自由基,殺死吞入的病菌[28],同時(shí)機(jī)體受到活性氧自由基的損傷后,抗氧化能力加強(qiáng),對多余的活性氧自由基加以清除,以維持機(jī)體正常[29]。在本試驗(yàn)中細(xì)胞中ACP活性是血清中的約62倍,T-AOC也較血清中高,這說明吞噬后的殺菌作用相關(guān)免疫活動(dòng)主要發(fā)生于體腔細(xì)胞中,而與血清關(guān)系不大。
C3是補(bǔ)體激活級聯(lián)反應(yīng)的中心成分,在病原體吞噬和殺滅中起著調(diào)理素的作用[8,19]。在紫球海膽中,C3通過物理標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞促進(jìn)吞噬作用[30]。C型凝集素具有調(diào)理素的功能,能夠促進(jìn)無脊椎動(dòng)物體腔細(xì)胞的吞噬作用[31-32]。本試驗(yàn)中,海膽受到黑嘴病病原菌脅迫后,吞噬細(xì)胞內(nèi)C3-pre和Clec4g基因相對表達(dá)量呈極顯著上調(diào),這與中間球海膽受到紅斑病病原菌脅迫后C3-pre和Clec4g相對表達(dá)量的變化相類似[18],說明C3-pre和Clec4g基因在吞噬作用中起促進(jìn)作用。Caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動(dòng)子[33],本試驗(yàn)中,Caspase-8相對表達(dá)量在48 h時(shí)約上調(diào)至0 h的2倍,極顯著高于0 h,這與草魚肝細(xì)胞受到脅迫后表達(dá)相類似[34],吞噬細(xì)胞凋亡是海膽應(yīng)對病原菌入侵的一項(xiàng)重要免疫措施。
近年來,海膽?zhàn)B殖過程中幾乎每年都會(huì)發(fā)生黑嘴病,由黑嘴病導(dǎo)致的大規(guī)模死亡現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生[4,6-7]。為有效開展疾病防控,目前亟須找到能代表海膽免疫能力或抗病能力的指標(biāo),從而對疾病的發(fā)生開展預(yù)測或篩選抗病能力強(qiáng)的親本。本研究中發(fā)現(xiàn),在黑嘴病病原菌脅迫后一定時(shí)間內(nèi),細(xì)胞凋亡率、單個(gè)吞噬細(xì)胞內(nèi)ACP、ROS和T-AOC,以及C3-pre、Caspase-8和Clec4g基因相對表達(dá)量均極顯著高于脅迫前,因此,這些參數(shù)均可作為海膽免疫能力或抗病能力的候選指標(biāo)。這些指標(biāo)只需抽取海膽體腔液就可以進(jìn)行測定,具有低損傷、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的優(yōu)勢,有望應(yīng)用到中間球海膽疾病防控研究和生產(chǎn)實(shí)踐中。關(guān)于指標(biāo)高低與抗病力的相關(guān)性,以及指標(biāo)的準(zhǔn)確性今后需進(jìn)一步研究。
1) 病原菌入侵初期,中間球海膽迅速發(fā)揮吞噬作用,主要表現(xiàn)為單個(gè)有效吞噬細(xì)胞內(nèi)ACP和活性氧含量分別上升約3倍和6倍,抗氧化能力上升約7倍,細(xì)胞內(nèi)C3-pre和Clec4g基因相對表達(dá)量分別上調(diào)約4倍和7倍,吞噬細(xì)胞密度迅速下降;在感染后期,吞噬細(xì)胞壞死率大幅上升,上述吞噬指標(biāo)均逐漸減弱。
2) 體腔細(xì)胞中ACP、ROS和T-AOC酶活性計(jì)算為單個(gè)吞噬細(xì)胞平均貢獻(xiàn)值后,以及C3-pre和Clec4g等基因的相對表達(dá)量能較好地反映海膽的免疫狀態(tài)。因此,這些參數(shù)可以作為海膽免疫能力或抗病能力的候選指標(biāo)。