陳琦，孫雨晴，鄭欣宜，山谷，李雅娟，曹小娟，朱新平，周賀*

(1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.華中農業(yè)大學 水產學院，農業(yè)農村部淡水生物繁育重點實驗室，農業(yè)動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，湖北 武漢 430070； 3.中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣東 廣州 510380)

雄核發(fā)育是指通過用放射線照射或其他方法完全使卵核的遺傳物質失活，僅把卵子作為營養(yǎng)源，依靠精子由來的精核發(fā)育成胚胎的現(xiàn)象[1]。由于雄核發(fā)育僅含有來源于父本的一套染色體組即單倍體，魚類單倍體雖能較好地通過胚胎發(fā)育，但到孵化期或孵化后數(shù)天，就會因“單倍體綜合征”而陸續(xù)死亡，因此，需要染色體加倍?，F(xiàn)有染色體加倍的主要方法是利用溫度、壓力刺激或化學誘變劑阻止第一次卵裂，但所獲得二倍體存活率極低。若用四倍體個體的精子(2n)使遺傳失活的卵子“受精”，染色體不用加倍可以直接獲得能正常發(fā)育的雄核發(fā)育二倍體后代。但人工誘導魚類四倍體難度大，如果某種魚類存在自然四倍體，則是解決染色體加倍難的最好方法。據(jù)報道，中國長江流域存在大量的自然四倍體泥鰍Misgurnusanguillicaudatus，研究發(fā)現(xiàn)，其是含有4套染色體組的遺傳四倍體(4n=100)，是同源四倍體，能產生正常的2n配子(雌或雄)[2-4]。本研究室林忠喬等[5]利用冷休克方法誘導自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體，有效解決了誘導魚類雄核發(fā)育二倍體的瓶頸，具有良好的應用前景。

無論是采用物理方法還是化學方法人工誘導雄核發(fā)育，由于遺傳失活卵子的處理并非百分之百成功，因此，雄核發(fā)育的倍性檢測和鑒定是判斷誘導成功與否的重要環(huán)節(jié)。魚類上常用的倍性鑒定方法有形態(tài)學鑒別、染色體核型分析、受精細胞學檢測、同工酶鑒定及分子標記等，其中，染色體核型、Ag-NORs及熒光原位雜交(FISH)是雄核發(fā)育后代倍性鑒定最直接和最準確的方法，但目前魚類雄核發(fā)育染色體鑒定方面還未見報道。因此，本研究中以自然四倍體泥鰍為父本，二倍體泥鰍為母本進行雜交，通過冷休克處理受精卵誘導雄核發(fā)育二倍體，并對其后代的染色體核型、Ag-NORs帶型及熒光原位雜交(FISH)信號等進行研究，旨在探索魚類雄核發(fā)育新途徑及自然四倍體泥鰍所產生的配子染色體組構成，并為四倍體雄性泥鰍是具有4套染色體組的遺傳四倍體提供遺傳學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用二倍體泥鰍(雌)取自大連市農貿市場，自然四倍體泥鰍(雄)取自湖北省赤壁市，暫養(yǎng)于大連海洋大學細胞遺傳功能實驗室水族箱中。挑選發(fā)育良好的二倍體雌魚、四倍體雄魚各1尾作為親本，二倍體雌魚體長為14.1 cm，體質量為17.3 g，四倍體雄魚體長為16.5 cm，體質量為29.6 g。親本的倍性經流式細胞儀檢測確定。

1.2 方法

1.2.1 人工催產及授精 雜交前一天晚間注射催產素絨毛膜促性腺激素(HCG)，二倍體雌魚注射劑量為 20～25 UI/尾，四倍體雄魚劑量減半，12 h后用稀釋1 000倍的苯甲醇將泥鰍麻醉，待雌魚麻醉后，擠卵并收集到鋪有保鮮膜的9 cm培養(yǎng)皿中，用毛細管收集精液于1.5 mL塑料離心管中(用精子稀釋液稀釋100倍)，干法授精(2n×4n)。

1.2.2 冷休克誘導雄核發(fā)育 具體方法參照本實驗室篩選出的誘導自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體各因素的最優(yōu)水平組合進行[5]，即受精后5 min，將一部分受精卵放入3 ℃冰水中，處理60 min。冷休克解除后將受精卵放回到(20±1)℃的曝氣水中進行孵化。未進行冷休克的一部分受精卵作為對照組(2n×4n)。

1.2.3 血紅細胞核體積測量 用苯甲醇稀釋液(1 mL/L)麻醉魚，抽血少許，迅速滴在載玻片上。風干后滴一滴甲醇于載玻片上，之后用體積分數(shù)10%的吉姆薩染色 5 min，自然風干后顯微拍照。隨機測量 50 個血紅細胞核的長徑(a)和短徑(b)，結果以平均值±標準差 (mean±S.D.) 表示，細胞核體積(V)按下式計算：

V=4/3×π (a/2)×(b/2)2。

1.2.4 單個胚胎染色體標本制備 取發(fā)育至肌肉效應期的胚胎處理組和對照組各30個，剝去卵膜和卵黃，用質量分數(shù)0.002 5%的秋水仙素處理45 min，質量分數(shù)0.8%的檸檬酸低滲20 min，再用預冷的卡諾固定液(甲醇與冰醋酸的體積比為3∶1)固定3次，每次15 min，最后于-20 ℃冷凍過夜。單個胚胎冷滴片，過火，風干。一部分用質量分數(shù)10%的吉姆薩染色45 min，在普通光學顯微鏡下鏡檢，油鏡下拍照。一部分白片用于Ag-NORs和FISH。

1.2.5 染色體核型分析 分別選取對照組雜交三倍體和處理組雄核發(fā)育二倍體中分散均勻、染色清晰、無重復的中期分裂相各5張，測量其長臂和短臂的長度，計算相對長度和臂比，參照Levan等[6]的方法進行核型分析。

1.2.6 Ag-NORs分析 參考Howell等[7]的快速銀染法，取100 μL質量分數(shù)50%的硝酸銀與50 μL質量分數(shù)2%的明膠混勻后滴在染色體標本上，加上蓋玻片，70 ℃下處理 2 min，用同樣溫度的水進行沖洗，自然干燥后鏡檢、拍照。

1.2.7 FISH分析 以人的5.8S+28S rDNA為探針，采用生物素(Biotin-16-dUTP)進行標記。標記后的探針用混合純化液進行純化。將純化后的探針在75 ℃恒溫水浴10 min進行變性；染色體玻片在65 ℃干燥箱烘干2～3 h，干燥后的染色體玻片浸在70 ℃體積分數(shù)70%的甲酰胺/2×SSC變性液中變性2 min。已變性并脫水的染色體玻片標本上加50 μL變性探針-雜交溶液混合液。蓋上封口膜置于2×SSC濕盒中，37 ℃下雜交18 h以上。雜交結束后置于洗脫液中洗脫，雜交信號檢測和放大，復染和封片，用Leica DM2000熒光顯微鏡觀察雜交信號，用Leica DF 450C CCD裝置捕獲圖像，用Leica和Photoshop軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 血紅細胞核體積

泥鰍血紅細胞呈橢圓形，核位于細胞中央，近橢圓形。對照組雜交三倍體泥鰍血紅細胞核體積為(38.29 ±3.14)μm3，處理組雄核發(fā)育二倍體泥鰍血紅細胞核體積為(27.92±3.58)μm3(表1，圖1)，雜交三倍體與雄核發(fā)育二倍體泥鰍血紅細胞核體積之比為1.37∶1,符合三倍體與二倍體血紅細胞核體積比1.5∶1。這表明，處理組雄核發(fā)育的染色體組構成為二倍體。

表1 對照組和處理組血紅細胞核測量結果

A—對照組雜交三倍體泥鰍；B—處理組雄核發(fā)育二倍體泥鰍。A—hybrid triploid in control group； B—androgenic diploid in treatment group.圖1 雜交三倍體泥鰍和雄核發(fā)育二倍體泥鰍的紅細胞Fig.1 Erythrocytes of hybrid triploid loach and androgenic diploid loach

2.2 染色體核型分析

對照組雜交三倍體泥鰍胚胎染色體數(shù)目為3n=75，核型公式為15m+6sm+54t，NF=96(表2，圖2A、B)；處理組雄核發(fā)育二倍體泥鰍胚胎染色體數(shù)目為2n=50，核型公式為10m+4sm+36t，NF=64(表2，圖2C、D)。

表2 雜交三倍體泥鰍和雄核發(fā)育二倍體泥鰍的染色體核型數(shù)據(jù)Tab.2 Indices of karyotype analyses in hybrid triploid loach and androgenic diploid loach

A、B—雜交三倍體泥鰍(3n=75)； C、D—雄核發(fā)育二倍體泥鰍(2n=50)。A and B—hybrid triploid (3n=75) loach； C and D—androgenic diploid (2n=50) loach.圖2 雜交三倍體泥鰍和雄核發(fā)育二倍體泥鰍胚胎染色體分裂相及核型Fig.2 Chromosome division and karyotype of embryos in hybrid triploid loach and androgenic diploid loach

2.3 FISH和Ag-NORs分析

以人的5.8S+28S rDNA為探針，對雜交三倍體泥鰍和冷休克雄核發(fā)育二倍體泥鰍的中期染色體進行FISH定位。在雜交三倍體泥鰍的3個染色體短臂的端部檢測到3個FISH雜交信號(圖3A、B)；雄核發(fā)育二倍體泥鰍的2個染色體短臂的端部檢測到2個FISH雜交信號(圖3C、D)。

在間期核中，Ag-NORs的數(shù)目均表現(xiàn)出不同的多態(tài)性,雜交三倍體泥鰍間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～3個，含有3個Ag-NORs的頻率最高，為75%(表3，圖3E)；雄核發(fā)育二倍體泥鰍間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～2個，含有2個Ag-NORs的頻率最高，為 87%(表3,圖3F)。雜交三倍體泥鰍胚胎染色體中，在3個染色體短臂的端部檢測到3個銀染點(圖3G、H)；雄核發(fā)育二倍體泥鰍胚胎染色體中，在2個染色體短臂的端部檢測到2個銀染點(Ag-NORs)(圖3I、J)。Ag-NORs結果與上述FISH定位結果一致，均表明處理組雄核發(fā)育二倍體泥鰍染色組構成為2套染色體組。

表3 間期核中核仁的頻率Tab.3 Number of nucleolus per interphase nucleus

A、G—雜交三倍體泥鰍; C、I—雄核發(fā)育二倍體泥鰍; E—雜交三倍體泥鰍間期核; F—雄核發(fā)育二倍體泥鰍間期核; B、D—FISH雜交信號; H、J—銀染點(Ag-NORs)。A and G—hybrid triploid; C and I—androgenic diploid;E—interphase nucleus of hybrid triploid;F—metachase nucleus in androgenic diploid; B and D—arrows indicate NORs shown by FISH signals; H and J—Ag staining.圖3 雜交三倍體泥鰍和雄核發(fā)育二倍體泥鰍胚胎染色體分裂相的FISH及Ag-NORs分析Fig.3 Chromosome division phases in embryos of hybrid triploid loach and androgenic diploid loach by FISH and Ag-NORs staining

3 討論

3.1 魚類雄核發(fā)育途徑

在水產養(yǎng)殖上，由于很多重要經濟魚類不同性別往往表現(xiàn)出不同的生產性能，如生長速度的快慢及性產物用途不同等。所以控制魚類的性別，選擇具有最佳生長性能的性別進行單性養(yǎng)殖，具有極為重要的應用價值。雄核發(fā)育是生產魚類全雄苗種的重要途徑，人工誘導魚類雄核發(fā)育的常規(guī)途徑(圖4(a))主要包括兩個步驟，即卵細胞染色體遺傳失活及精子染色體加倍。在魚類雄核發(fā)育中常用的卵細胞染色體遺傳失活手段是射線照射(γ射線、Х射線及紫外線),此種滅活方法雖然簡單易行，但是用射線破壞卵子細胞核的同時，細胞質和其他細胞器也會遭受到不同程度的破壞，導致其受精后不能正常發(fā)育，成活率極低。Purdom[8]使用60C0-γ射線照射川鰈Platichthysflesus卵子，隨后與川鰈精子受精，獲得雄核發(fā)育單倍體胚胎。Thorgaard等[9]使用四倍體虹鱒Oncorhynchusmykiss精子與γ射線照射后的虹鱒卵子受精，成功獲得虹鱒二倍體雄核發(fā)育后代。Arai等[10]使用γ射線照射雌性馬蘇大馬哈魚Oncorhynchusmasou卵子，與雄性馬蘇大馬哈魚精子結合，成功得到35%的單倍體。Grunina等[11]與Corley-Smith等[12]分別用25～30 kR、15 kR的X射線強度照射鯉Cyprinuscarpio和斑馬魚Daniorerio卵子，與對應雄魚精子受精，得到了12%和14%的雄核發(fā)育單倍體后代。

因此，無須卵子失活，快速、高效生產雄核發(fā)育個體成為亟待解決的關鍵問題。

本研究中，不用射線照射僅讓受精卵在低溫環(huán)境刺激下產生雄核發(fā)育的新途徑(圖4(b))，目前國內外鮮有報道。最早Gervai等[13]利用冷休克方法除獲得三倍體外，也獲得雄核發(fā)育單倍體胚胎。Ueda[14]發(fā)現(xiàn),在虹鱒受精后30 s或3.5 h后用熱休克(30 ℃，7 min)可獲得少量的雄核發(fā)育二倍體個體。近年來，日本學者Morishima等[15]報道了泥鰍受精后利用3 ℃低溫水處理受精卵60 min能誘導產生雄核發(fā)育后代,并報道了冷休克誘導雄核發(fā)育的細胞學機制是卵核與第二極體一同釋放。Hou等[16]報道了斑馬魚受精卵在7 ℃水中處理30 min單倍率最高，并得到克隆二倍體個體。本研究室王玉生等[17]報道了大鱗副泥鰍受精卵在3 ℃冰水處理60 min，可產生雄核發(fā)育單倍體，其細胞學機制與Morishima等[15]報道的相一致，即卵核與第二極體一同釋放；本研究室Zhou等[18]利用二倍體泥鰍♀與自然四倍體泥鰍♂雜交產生的受精卵進行了冷休克誘導雄核發(fā)育(受精后5 min，放入3 ℃冰水處理60 min)，并通過對后代的染色體數(shù)目、親子鑒定、初期胚胎觀察，闡明了該方法可成功誘導雄核發(fā)育二倍體泥鰍，誘導率為73.33%，此人工誘導雄核發(fā)育新途徑效果明顯高于其他途徑，其細胞學機制也是卵核與第二極體一同釋放。關于卵核與第二極體一同釋放的分子機制尚不清楚，有待于今后進一步探究。利用自然四倍體泥鰍誘導雄核發(fā)育二倍體可以省去精子染色體的加倍，提高成活率。本研究中參照Zhou等[18]報道的冷休克誘導雄核發(fā)育的最優(yōu)參數(shù)進行了自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體的誘導，從分子遺傳學角度探討了冷休克誘導自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的染色體組構成。

3.2 染色體核型分析

一個物種的染色體數(shù)目及形態(tài)特征稱為該物種的核型(karyotype)，包括染色體數(shù)目(即基數(shù))及每一條染色體所特有的形態(tài)特征(染色體大小、著絲點的位置及次縊痕、隨體的有無等)。對這些特征進行定量和定性的描述，即核型分析(karyotype analysis)[19]，染色體核型是染色體研究中的一個基本方法，它對物種的親緣關系、系統(tǒng)演化、起源、染色體鑒別等研究具有重要意義。本研究中，以大連當?shù)囟扼w泥鰍(2n=50)為母本，湖北省的自然四倍體泥鰍(4n=100)為父本進行雜交,其中一部分受精卵在受精后5 min，放入3 ℃冰水中處理60 min,經冷休克處理后獲得了染色體數(shù)目為50條的二倍體泥鰍(2n=50),未經冷休克處理的對照組染色體數(shù)目為75條(3n=75)。顯而易見，冷休克處理后沒有使第二極體受到抑制，因為如果抑制第二極體釋放的話將形成四倍體后代。本研究中經染色體核型分析,對照組核型公式為15m+6sm+54t，NF=96，冷休克處理組核型公式為10m+4sm+36t，NF=64。這與以往李雅娟等[20]報道的二倍體泥鰍染色體核型一致。由此可見，冷休克成功誘導了自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體。表明中國自然四倍體雄性泥鰍能產生二倍體(2n)配子。該研究結果不僅為魚類雄核發(fā)育增加了新途徑，也為四倍體雄性泥鰍是具有4套染色體組的遺傳四倍體提供了重要的遺傳學證據(jù)。

3.3 銀染法在魚類倍性鑒定中的應用

Ag-NORs法在魚類染色體研究中被廣泛應用，該方法是研究染色體進化和物種親緣關系的一個重要指標。研究表明，細胞中的核仁數(shù)目與染色體組數(shù)目有關，大多數(shù)物種具有一套染色體組的單倍體細胞中僅含1個核仁，具有2、3、4套染色體組的二、三和四倍體細胞分別含2、3、4個核仁。在多倍體魚類的倍性鑒定中，Ag-NORs 法與其他倍性檢測方法相比具有快捷、準確且省時省力的優(yōu)點,尤其在條件比較簡陋的情況下無須特殊的儀器就可以進行，是值得推廣的方法。李雅娟等[21-22]對40余種鯉科魚類與德國鏡鯉的銀染核型進行了比較，發(fā)現(xiàn)多數(shù)中國鯉科魚類的Ag-NORs數(shù)目為 4，而德國鏡鯉具有2個Ag-NORs，說明其染色體倍性是原始類型，是二倍化的四倍體，即染色體數(shù)目為2n=100，這種二倍化的四倍體只能產生單倍體配子(n=50),但無論是雌核還是雄核發(fā)育子代因單倍體均不能存活，需要進行染色體加倍才能存活。Li等[3-4]對自然二倍體和四倍體泥鰍、雌核發(fā)育后代進行了Ag-NORs分析，闡明了中國自然四倍體泥鰍是含有4套染色體組的遺傳四倍體，即染色體數(shù)目為4n=100，這種遺傳四倍體能產生二倍體配子(2n=50),無論是雌核還是雄核發(fā)育子代均為二倍體(2n=50)，因此，不需要進行染色體加倍也能存活。本研究中，對雜交三倍體泥鰍及雄核發(fā)育二倍體泥鰍進行了Ag-NORs分析，結果顯示，對照組雜交三倍體泥鰍染色體具有3個銀染點，而處理組雄核發(fā)育二倍體泥鰍染色體具有2個銀染點，這表明自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育后代是含有2套染色體組的二倍體。

3.4 染色體熒光原位雜交在魚類倍性鑒定中的應用

FISH是指通過分子雜交和熒光顯微鏡進行特定DNA序列檢測的技術，F(xiàn)ISH不僅是研究基因組組成的有效手段，也是分析不同基因組染色體交叉互換現(xiàn)象和染色體減數(shù)分裂過程中行為的重要工具。FISH技術在魚類基因定位中的應用主要集中在rDNA定位上,這方面的研究對于魚類染色體的進化具有重要意義。rDNA在染色體上的定位可以對傳統(tǒng)核型的分析進行校正，尤其對于染色體較小且形態(tài)特征不明顯的材料，可以提高同源染色體配對的準確性。利用FISH技術，定位rDNA研究核仁組織區(qū)(NORs)，從而為魚類染色體結構和功能分析提供理論基礎。與其他方法不同的是，F(xiàn)ISH技術不依賴物種的核仁組織區(qū)是否有轉錄活性，而是直接針對rDNA。Li等[3-4，23]對自然二倍體和四倍體泥鰍、雌核發(fā)育后代及其雜交三倍體泥鰍的染色體進行了FISH研究，從分子細胞遺傳學角度闡明了不同倍性泥鰍的染色體組成。本研究中對雜交三倍體泥鰍及雄核發(fā)育二倍體泥鰍進行了FISH分析，結果顯示，對照組雜交三倍體泥鰍染色體具有3個雜交信號，雄核發(fā)育二倍體泥鰍染色體具有2個雜交信號，再次證明自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育后代是含有2套染色體組的二倍體。

4 結論

1)通過染色體核型、Ag-NORs、FISH等方法對雄核發(fā)育二倍體泥鰍染色體組構成進行分析，均鑒定出自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育后代的染色體組構成是含有2套染色體組的二倍體，并證明自然四倍體雄性泥鰍是具有4套染色體組的遺傳四倍體。

2)無須卵子失活或卵子染色體加倍，僅用冷休克可以成功誘導自然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體，表明中國自然四倍體雄性泥鰍能產生二倍體(2n)配子。