金美華，李維龍，練旭冬，賀鑫梅，陳艷，申貴男，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

2017 年國家統(tǒng)計(jì)局公布最新人口數(shù)據(jù)，60 歲及以上人口占總?cè)丝诘?7.3%，占全球老年人口的總量的1/4，我國將面臨未富先老的困境的同時(shí)，衰老相關(guān)疾病也將接踵而來[1-3]。皮膚作為人體的重要器官，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，不僅是體內(nèi)脆弱組織與外界環(huán)境之間的堅(jiān)實(shí)壁壘，同時(shí)還發(fā)揮著維持體溫、保存水分、感覺和免疫監(jiān)視等作用[3-4]。衰老的皮膚將經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能上的退化，表現(xiàn)出皮膚松弛、色素沉積等現(xiàn)象，這不僅會(huì)使皮膚的美觀程度大打折扣，而且會(huì)使皮膚更容易受到外來傷害[5]。絕大部分的皮膚老化起始于真皮層，表現(xiàn)為真皮層變薄、膠原含量減少，主要原因是成纖維細(xì)胞數(shù)量的減少及功能的下降。真皮成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化導(dǎo)致老化皮膚更容易受到損傷且損傷后更加難以愈合[6]。因此尋找一種治療老化皮膚損傷愈合的藥物迫在眉睫。

我國天然紫草提取物具有良好的抗菌[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、抗瘧疾[10]以及延緩機(jī)體衰老的作用[11-12]。有研究表明紫草提取物具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基從而延緩衰老的作用，并且主要成分為紫草的軟膏已應(yīng)用于臨床治療皮膚的燒傷、水火燙傷[13-14]。但是紫草有效成分很多，成分復(fù)雜，相關(guān)治療機(jī)制并不十分明確，而紫草的主要成分萘醌類化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大，萘醌類化合物治療皮膚損傷愈合相關(guān)研究較少，并無治療老化皮膚損傷愈合藥物的相關(guān)報(bào)道。因此，實(shí)驗(yàn)室以紫草的主要成分1，4 二甲氧基苯為起始物，以增強(qiáng)其優(yōu)良的生物活性為目的，設(shè)計(jì)并合成2-異丁胺基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（MPAD）用于老化皮膚損傷愈合的實(shí)驗(yàn)研究，明確MPAD 與老化皮膚損傷愈合之間的關(guān)系，闡明MPAD治療老化皮膚損傷愈合的相關(guān)分子機(jī)制，為紫草類衍生物對(duì)老化皮膚損傷的治療提供理論依據(jù)，為老齡動(dòng)物的皮膚損傷治療提供候選化合物，為臨床治療老化皮膚損傷提供新方法和思路，對(duì)皮膚損傷疾病的治療具有潛在的價(jià)值與意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

蘇木精、伊紅，索萊寶公司；TE、FBS，Gibocol 公司；DMEM、HBSS，Hyclone 公司；無水乙醇、二甲苯，泉瑞試劑公司；1，4-二甲氧基苯、馬來酸苷，阿拉丁公司；無水三氯化鋁，麥克林公司。

1.2 材料儀器

小型臺(tái)式冷凍離心，1-15K，Sigma 公司；冷凍真空干燥機(jī)，F(xiàn)0-1B-55，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；病理組織切片機(jī)、包埋機(jī)、攤片機(jī)，Leica 公司；超白載玻片、蓋玻片，上海世泰公司；高速離心機(jī)購自湘儀儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 只10 月齡SPF 級(jí)體重相似的129/SvJ 健康小鼠，自由飲食與飲水。129/SvJ 品系小鼠由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，疾病模式動(dòng)物研究中心提供。

1.4 細(xì)胞

由野生型129/SvJ 小鼠提取的小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞。

1.5 方法

1.5.1 MPAD 合成過程

以1，4-二甲氧基苯為起始物，通過傅克反應(yīng)、甲基化反應(yīng)及氧化反應(yīng)得到中間體5，8-二甲氧基-1，4-萘醌，利用2-甲基丙胺通過邁克爾加成反應(yīng)得到MPAD（下圖為MPAD 的合成路線）。

1.5.2 H&E 染色

用頸椎脫臼法處死小鼠，對(duì)小鼠背部傷口部位的皮膚進(jìn)行標(biāo)記并取樣，將皮膚樣品放入福爾馬林中24 h，水洗（1.5 h），組織脫水機(jī)脫水（9.5 h），包埋機(jī)包埋，冷動(dòng)臺(tái)冷凍，將蠟塊放于-20 ℃冰箱保存。組織切片機(jī)切片并將切好的組織平攤到載玻片上（組織厚度為5 μm），自然干燥2 d，進(jìn)行脫蠟及H&E 染色。具體過程如下：二甲苯（10 min）；二甲苯（10 min）；100%酒精（1.5 min）；90%酒精（1 min）；80%酒精（1 min）；50%酒精（1 min）；水洗（3 min）；蘇木精（5 min）；水洗（3 min）；酸性乙醇（2 s）；水洗（3 min）；0.8%氨水（2 s）；水洗（5 min）；伊紅（20 s）；90% 酒精（1 min）；95%酒精（1 min）；100%酒精（1 min）；二甲苯（3 min）；中性樹脂封片。

1.5.3 小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞的提取

取1～2 d129/SvJ 新生小鼠，75%酒精浸泡消毒殺菌（2 min），含慶大霉素HBSS 浸泡（2 min），去除小鼠頭部、尾部及四肢，沿腹中線將小鼠皮膚剪開，取下小鼠皮膚并剔除皮膚中血管及脂肪，將皮膚剪成3 mm 大小并貼在培養(yǎng)瓶的底部，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶后放置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱（2.5 h），添加培養(yǎng)液，3 d 后更換培養(yǎng)液，一周后傳代，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 SA-β-gal 染色

將真皮成纖維細(xì)胞以10 萬個(gè)每孔種在3.5 cm培養(yǎng)皿；24 h 后棄上清液后PBS 清洗一次；加入2 mL 0.5%戊二醛溶液，避光孵育20 min；2 nM PBS 洗液清洗一次；加入2 ml 染色液，37 ℃培養(yǎng)箱（無CO2）孵育2 d 后照相。

1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS

真皮成纖維細(xì)胞以每板3×105個(gè)細(xì)胞種于3.5 cm培養(yǎng)皿中。24 h 后換液并進(jìn)行加藥處理，對(duì)照組加入等體積的PEG，48 h 后回收細(xì)胞，PBS 清洗一次，加入10 mmol·L-1的CM-H2DCFDA，二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育10 min，離心后棄掉上清液體，用PBS 重新吹打懸浮后轉(zhuǎn)移到流式管中，通過流式細(xì)胞儀檢測其熒光強(qiáng)度。每組均重復(fù)3 次。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差異采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 MPAD 促進(jìn)小鼠皮膚損傷愈合

為研究MPAD 是否具有加快皮膚損傷愈合的作用，通過小鼠皮膚線性傷口造模，局部涂抹MPAD（濃度分別為1、10 μm·L-1），對(duì)照組涂抹溶劑PEG 處理，并分別在第0、3、5、7 d 照相觀察傷口愈合的情況（如圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明MPAD 可以促進(jìn)小鼠皮膚損傷的愈合，并成濃度依賴性。經(jīng)病理組織切片、HE 染色分析局部涂抹后對(duì)傷口愈合影響（如圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物處理組傷口愈合情況明顯好于對(duì)照組。

圖1 創(chuàng)傷后第0、3、5、7 d 觀察創(chuàng)傷愈合情況Fig.1 Observed healing results on day 0，3，5 and 7 after the trauma

圖2 H&E 染色分析傷口愈合情況Fig.2 H&E staining analysis of wound healing

2.2 MPAD 可以延緩小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞的衰老來維持細(xì)胞良好狀態(tài)

為探究MPAD 與老化皮膚損傷愈合之間關(guān)系，實(shí)驗(yàn)利用SA-β-GAL 染色對(duì)小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞的衰老情況進(jìn)行分析。真皮成纖維細(xì)胞在皮膚損傷愈合過程中極為重要，真皮成纖維細(xì)胞增殖遷移填充傷口部位的速度與時(shí)間決定著皮膚損傷愈合的速度。當(dāng)真皮成纖維細(xì)胞衰老后，其生理功能發(fā)生改變，增殖、遷移能力下降，并且在創(chuàng)傷形成后的氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的衰老，影響細(xì)胞的正常功能，這也導(dǎo)致了老化皮膚損傷極難愈合。因此，實(shí)驗(yàn)采用小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，藥物處理組濃度為800 nmol·L-1，對(duì)照組加入等體積的PEG。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，MPAD 在處理組真皮成纖維細(xì)胞衰老得到了抑制，并且隨著細(xì)胞代數(shù)的增長，這一現(xiàn)象更加明顯，證明MPAD 可以有效的延緩真皮成纖維細(xì)胞的衰老（圖3 為X-Gal 染色結(jié)果，圖4 為圖3的定量分析）。

圖3 MPAD 對(duì)小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞（4 P、5 P、6 P）衰老影響Fig.3 Effects of MPAD on senescence of primary dermal fibroblasts（4 P，5 P，6 P）in mice

圖4 圖3 的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.4 Statistical analysis of figure 3

2.3 MPAD 可以降低小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS 的表達(dá)

為探究MPAD 影響老化皮膚損傷愈合的原因，以及MPAD 抑制小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MPAD 對(duì)小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響。當(dāng)發(fā)生皮膚損傷后，ROS 的含量會(huì)大量增高，ROS 是造成細(xì)胞衰老的主要因素，而皮膚老化恰恰導(dǎo)致了傷口難以愈合。因此，實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MPAD 對(duì)ROS 水平的影響。MPAD 處理組濃度為800 nmol·L-1，對(duì)照組加入等體積的PEG，分別處理小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPAD 可以有效地降低真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平。當(dāng)創(chuàng)傷形成時(shí)ROS 的水平會(huì)明顯升高并且老化的皮膚中ROS 水平相對(duì)較高，對(duì)皮膚的愈合功能造成不利影響。實(shí)驗(yàn)證明MPAD 可以降低小鼠真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，抑制真皮成纖維細(xì)胞衰老，從而維持真皮成纖維細(xì)胞良好的狀態(tài)，加速皮膚損傷的愈合。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測MPAD 對(duì)小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS 表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of MPAD on ROS expression in primary dermal fibroblasts was determined by flow cytometry

3 討論

經(jīng)久不愈的傷口，不僅給老年人身體行動(dòng)上造成困擾，并給他們上心靈造成難以言喻的傷害，甚至使一個(gè)家庭為其擔(dān)憂。皮膚損傷包括術(shù)后傷口、擦傷、褥瘡、糖尿病性潰瘍等，皮膚損傷愈合過程也極為復(fù)雜。包括早期止血、創(chuàng)面保護(hù)、炎癥控制及多種組織細(xì)胞增生，新生血管的形成，創(chuàng)緣的爬行收縮等[15-16]。皮膚老化的過程中，真皮成纖維細(xì)胞具有很重要的作用，其通過增殖、遷移填充傷口區(qū)域，釋放膠原蛋白、彈性蛋白收縮傷口區(qū)域，減少傷口面積來促進(jìn)損傷愈合[17]。當(dāng)皮膚老化后，真皮層逐變薄，彈性下降，韌性下降，受到外來傷害時(shí)更容易出現(xiàn)損傷，且真皮成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老后，其增殖速度、遷移速度顯著下降，導(dǎo)致其愈合速度顯著降低，甚至經(jīng)久不愈引發(fā)潰爛威脅我們的生命健康[18-19]。而在皮膚老化與皮膚損傷愈合的過程中，ROS 扮演著極其重要的角色[20-21]。

隨著研究的不斷深入，越來越多的研究表明ROS 在衰老過程中的重要性[22-23]，甚至有報(bào)道稱ROS是肌體衰老的罪魁禍?zhǔn)譡24]。ROS 主要包括超氧陰離子和羥基自由基等，是造成核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)損傷的主要物質(zhì)，也是導(dǎo)致皮膚老化的主要元兇[25-27]。同時(shí)，ROS 與皮膚損傷愈合之間關(guān)系也十分密切，甚至被認(rèn)為調(diào)控著傷口愈合的全部過程[28-29]。當(dāng)皮膚受到外界刺激發(fā)生損傷后，受傷部位ROS 含量也會(huì)大量增加，這也間接導(dǎo)致老化皮膚的損傷難以愈合。而目前治療皮膚損傷的藥物有很多，但老化皮膚其皮層結(jié)構(gòu)與功能已發(fā)生變化，細(xì)胞功能受損，致使普通治療藥物藥效不明顯。

紫草是我國中草藥的一種，廣泛應(yīng)用于燒燙傷，具有抗炎、抑菌的良好效果，并且紫草與ROS 之前密切相關(guān)。紫草主要活性成分是萘醌類化合物，但是萘醌類化合物毒性很強(qiáng)，很難應(yīng)用于臨床，因此我們實(shí)驗(yàn)室以紫草的提取物1，4 二甲氧基苯為起始物，以增強(qiáng)其優(yōu)良生物活性及清除ROS 的能力，降低其毒副作用為目的，對(duì)化合物進(jìn)行構(gòu)效分析，篩選有效的取代基，并對(duì)萘醌類衍生物進(jìn)行設(shè)計(jì)與合成。已有研究結(jié)果顯示萘醌類化合物的5，8 位羥基是產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要基團(tuán)[30-32]。在分析萘醌類化合物細(xì)胞毒性的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，我們以1，4-二甲氧基苯為起始物，通過甲基化、傅克反應(yīng)和氧化反應(yīng)合成了中間體5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。為研究2 位取代基對(duì)清除活性氧的影響，又通過邁克爾加成反應(yīng)合成了一系列2-取代衍生物，對(duì)其細(xì)胞毒性及活性氧清除作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)異丁胺基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌活性最強(qiáng)，并且產(chǎn)生較強(qiáng)的清除ROS 能力，而皮膚老化正是由ROS 所引起，因此，我們根據(jù)前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MPAD 良好的清除ROS 能力及其生物學(xué)活性，探究MPAD 對(duì)老化皮膚損傷愈合的影響。

結(jié)果表明，MPAD 處理后老齡小鼠傷口愈合速度明顯加快。通過X-Gal 染色發(fā)現(xiàn)MPAD 處理后小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞的衰老得到了明顯的抑制。因此推測MPAD 加速老化皮膚的損傷愈合是通過延緩細(xì)胞的衰老，維持細(xì)胞良好的狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的。ROS 是皮膚老化的元兇之一，并且在傷口發(fā)生時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS 導(dǎo)致氧化應(yīng)激延誤傷口的愈合。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)MPAD 可以降低小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平。結(jié)果表明，MPAD 可以通過降低小鼠真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS 水平延緩衰老，維持細(xì)胞自身良好狀態(tài)，從而促進(jìn)老化皮膚的損傷愈合。研究為萘醌類衍生物抗衰老、促進(jìn)傷口愈合提供基礎(chǔ)，為老化皮膚損傷的治療提供理論理論依據(jù)，為衰老相關(guān)疾病的治療提供方向。