方雨，蘇峰，劉為中，何廣衛(wèi)，*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 300；.合肥醫(yī)工醫(yī)藥股份有限公司，合肥 30088；3.中國藥科大學(xué)，南京 0009）

早在1976年Gerstel 等[1]就提出了微針遞送藥物系統(tǒng)這一概念，Henry 等[2]在1998年首次提出微針可以增強藥物在皮膚中傳遞的觀點。微針是指一系列針長為25 ～1000 μm 的針狀結(jié)構(gòu)[3]，可分為固體微針、中空微針和生物可降解微針，由于固體微針和中空微針采用硅材料制備，具有相容性差和不可降解等缺點，因此引出生物可降解聚合物微針的概念[4]。

目前，常用于制備生物可降解微針的聚合物材料有聚乙烯吡咯烷酮[5]、聚乙烯醇[6]、透明質(zhì)酸鈉[7]、葡聚糖[8]、硫酸軟骨素等[9]。查閱文獻可知，這些聚合物材料根據(jù)力學(xué)性能，可分為韌性材料和脆性材料[10]。韌性材料具有一定的柔韌性，但作為單一材料使用時會因為機械力度不足而無法刺入皮膚；脆性材料具有一定的機械力度，但作為單一材料使用時會因為過脆而發(fā)生斷裂，所以本研究將韌性材料和脆性材料復(fù)合，嘗試制備出力學(xué)性能優(yōu)良的可溶性的微針。

本文以胰島素為模型藥物，篩選多種常見生物可降解的韌性和脆性聚合物材料，并對制備的可溶性微針進行表征，根據(jù)單一基質(zhì)材料制備胰島素可溶性微針的結(jié)果，來篩選最佳的復(fù)合處方制備胰島素可溶性微針。

1 材料

1.1 儀器與試藥

LEICA DM500 正顯微鏡（Leica Mirosystome）；TDZ5-WS 臺式低速自動平衡離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；干燥器（透明240 nm 內(nèi)徑，泰州蘇北實驗用品有限公司）；AL104 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；B20002 電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；微針模具（臺州徽芯醫(yī)藥科技有限公司，H820UM 陣列3*3）。

胰島素（規(guī)格：10 g，徐州萬邦金橋制藥有限公司，批號：UP200501）；聚乙烯吡咯烷酮 K17（PVP K17，批號：0002441704）、聚乙烯吡咯烷酮K32（PVP K32，批號：0002361452）、聚乙烯吡咯烷酮 K90（PVP K90，批號：0002339967）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號：C191644）（上海森君化工制劑輔料有限公司）；透明質(zhì)酸鈉（HA-Na，分子量5000 及分子量15 w）（西安小草植物科技有限公司）；聚乙烯醇（PVA17-88，批號：20191207；PVA24-88，批號：20180905）（江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司）；羥丙基甲基纖維素（HPMC，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司，批號：PDR491709）；硫酸軟骨素（CS，批號：PB200315，陜西帕尼爾生物科技有限公司）；乳糖（批號：200402）、糊精（批號：190129）、預(yù)膠化淀粉（批號：200115）（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；莧菜紅色素（西安依諾進出口貿(mào)易有限公司，批號：RP16070401）；實驗用水均為去離子水。

1.2 動物

SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量200 ～250 g[許可證為SCXK（皖）2017-001，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心]。

2 方法與結(jié)果

2.1 可溶性微針制備工藝研究

經(jīng)過前期的預(yù)實驗，以聚二甲基硅氧烷（PDMS）為材料作為制備微針的陰模具，采用離心澆注入模法[11-12]來制備胰島素可溶性微針。首先將一定量的含藥基質(zhì)溶液用膠頭滴管均勻地滴加到微針模具上，4000 r·min－1離心15 min，然后除去模具表面多余的含藥基質(zhì)溶液，添加背襯層溶液，最后放置在硅膠干燥器中干燥過夜。

2.2 可溶性微針的處方篩選

2.2.1 HCl 溶液配制 2020年版《中國藥典》記載胰島素能夠溶解于稀鹽酸中，在pH 2 ～3 的稀鹽酸溶液中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并能全部溶解。因此，參照藥典方法，取0.9 mL 的濃鹽酸，用水稀釋至1000 mL，配制成濃度為0.01 mol·mL－1、pH 為2 的HCl 溶液，作為胰島素和制備微針的溶劑。

2.2.2 單一基質(zhì)材料制備微針篩選 采用多種常見的基質(zhì)材料單獨制備可溶性微針，以微針的外觀形態(tài)、力學(xué)性能和吸濕性為評價指標(biāo)，考察單一聚合物材料制備的微針的性能。其中對成形性的評價標(biāo)準(zhǔn)是：含針率達到100%為好，達到80%為良好，低于80%為差。對機械性的評價標(biāo)準(zhǔn)是：能夠順利穿過鋁箔紙為良，不能穿過鋁箔紙為差。對吸濕性的評價標(biāo)準(zhǔn)是：放置在高濕環(huán)境12 h 后仍能夠順利穿過2 層以上鋁箔紙的微針吸濕性為小，只能穿過1 層鋁箔紙的微針吸濕性為中，不能穿過鋁箔紙的微針吸濕性為差。結(jié)果見表1，可見，單一基質(zhì)材料制備的微針僅僅只是在某一方面具有優(yōu)良的性能。

表1 單一基質(zhì)材料制備微針的結(jié)果Tab 1 Microneedles prepared with a single matrix material

由表1可知，PVA17-88、PVA24-88、CMC-Na、HA-Na、PVP K17、PVP K32、CS 和PVP K90 等基質(zhì)材料基本符合制備微針的要求，其中PVA17-88、PVA24-88、CMC-Na 和HA-Na 屬于韌性材料，CS屬于脆性材料，PVP K17、PVP K32 和PVP K90，既屬于韌性材料也屬于脆性材料，因為PVP K17 吸濕性大，不作為復(fù)合材料的篩選，其他基質(zhì)材料如乳糖、糊精、玉米淀粉B 和HA-Na（分子量5000）等因成形性和機械性都差，所以也不作為制備微針的復(fù)合基質(zhì)材料的篩選。

2.2.3 復(fù)合基質(zhì)材料制備微針篩選 根據(jù)單一基質(zhì)材料制備微針的篩選結(jié)果，進行復(fù)合基質(zhì)材料的篩選。將韌性材料和脆性材料進行復(fù)合，按表2的處方制備復(fù)合可溶性微針。觀察成形性、機械性和吸濕性，并對微針進行壓變性能測試，即將可溶性微針背面朝上置于載玻片上，再在微針背面上加一個平面，使微針能夠均勻受力，將不同重量的砝碼放置于微針的背面1 min，然后置于顯微鏡下觀察針尖的彎曲程度[13]。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合基質(zhì)制備微針的結(jié)果Tab 2 Microneedles prepared with composite matrix

由表2可知復(fù)合基質(zhì)材料制備可溶性微針的綜合評價比單一基質(zhì)材料制備的可溶性微針要好。經(jīng)過處方篩選和壓變性能測試，最終篩選出的復(fù)合基質(zhì)材料是CS ＋PVP K90，該復(fù)合基質(zhì)材料制備的可溶性微針外觀形態(tài)好，力學(xué)性能好。

2.2.4 復(fù)合基質(zhì)材料CS 和PVP K90 復(fù)合比例篩選 CS 和PVP K90 的比例會影響微針的機械性和吸濕性。將復(fù)合基質(zhì)材料CS 和PVP K90 進行不同配比篩選，篩選方案為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1 和3∶2，結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合基質(zhì)材料CS 和PVP K90 不同配比的處方篩選結(jié)果Tab 3 Prescription screen of different ratios between CS and PVP K90

結(jié)果表明，CS 與PVP K90 不同配比制備的可溶性微針，配比在2∶1、3∶1 以及3∶2 時制備的可溶性微針成形性和機械性都差；配比在1∶2、1∶3、2∶3 時，較強的吸濕性降低了可溶性微針的穩(wěn)定性。因此最終選擇的CS 與PVP K90 的配比為1∶1。

2.2.5 可溶性胰島素微針載藥量的優(yōu)化 可溶性微針的載藥量和其他劑型相比相對較少，這也是限制微針應(yīng)用的原因之一。增加藥物在基質(zhì)溶液的占比是提高微針載藥量的最常見辦法，然而胰島素屬于生物大分子藥物，因此增加藥物在基質(zhì)溶液中的比例會降低微針的力學(xué)性能[14-15]。對藥物在CS ＋PVP K90 的混合基質(zhì)溶液的占比進行篩選，可以確保既能夠提高微針載藥量又能夠保證其機械性能。篩選方案和結(jié)果見表4。

表4 不同載藥量的微針處方Tab 4 Microneedle prescriptions with different drug loading

當(dāng)載藥量達到45%時，制備的微針成形性差，針長大小不一，因此選擇的最佳處方工藝為40%INS、7%CS、7%PVP K90 和46%的HCl，使用該處方制備的胰島素可溶性微針成形性好，力學(xué)性能優(yōu)良。置于顯微鏡下觀察，微針陣列整齊，針長均一，外觀形態(tài)好，力學(xué)性能優(yōu)良，見圖1。

圖1 可溶性胰島素微針顯微鏡下圖Fig 1 Soluble insulin microneedle microscopy

2.2.6 皮膚穿刺性能的測試 取大鼠離體皮膚，除去皮下脂肪，角質(zhì)層朝外平鋪，將可溶性胰島素微針垂直刺入皮膚，保持刺入狀態(tài)1 min，立即用莧菜紅色素進行染色，用異丙醇除去多余莧菜紅色素染料，然后將皮膚置于顯微鏡下觀察，并拍照[16]。如圖2所示，微針穿刺后的鼠皮，針孔清晰可見，說明胰島素微針可以很好地刺入皮膚。

圖2 可溶性胰島素微針刺入皮膚后的染色圖Fig 2 Staining image of soluble insulin microneedles after piercing the skin

2.2.7 體外溶解性測試 取大鼠離體皮膚，優(yōu)選復(fù)合處方工藝制備的胰島素微針，以一定力度刺入皮膚，分別于30 s、60 s 和120 s 移除微針，置于顯微鏡下觀察微針的溶解情況[17]，結(jié)果如圖3所示，微針刺入皮膚后2 min 內(nèi)基本溶解。

圖3 微針刺入皮膚溶解圖Fig 3 Microneedle penetration into the skin to dissolve

3 討論

3.1 制備微針方法的選擇

制備微針的方法有離心入模法、超聲入模法和抽真空入模法等，課題組前期預(yù)實驗對這3 種方法優(yōu)缺點進行比較，發(fā)現(xiàn)超聲入模法制備微針耗時長，微針成形性差；抽真空入模法在制備微針時基質(zhì)溶液抽真空氣泡多，干燥后的微針不完整，成形性差；離心入模法制備工藝簡單高效，微針成型好，力學(xué)性能優(yōu)，最終本實驗選擇離心入模法制備胰島素可溶性微針。

3.2 微針綜合物理性能評價方法的選擇

通過觀察微針的成形性、機械性和吸濕性等指標(biāo)來評價微針的性能，這種方法比較單一，后期應(yīng)該采用更加全面的方法，例如使用物性分析儀測定微針的斷裂力、使用電阻抗法測定微針是否刺入皮膚以及使用皮膚切片染色和光學(xué)相干斷層掃描可以直接觀察微針是否刺入皮膚以及刺入的深度等方法。

本研究以胰島素為模型藥物，選擇生物可降解的復(fù)合基質(zhì)材料，采用離心入模法制備胰島素可溶性微針，該方法操作簡單快速，制備的微針成形性好，力學(xué)性能優(yōu)良，為胰島素新劑型的研究奠定了一定基礎(chǔ)。