車巧林， 董彥鵬，劉茂軍，耿曉眉，繆芬芳

(1. 江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇 江陰 214400；2. 江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo)是引起豬支原體肺炎的主要病原，在豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。20世紀(jì)90年代后期，北美和歐洲出現(xiàn)了豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)[1-2]。PCV2感染后除引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)外，還引起豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、母豬繁殖障礙、新生仔豬先天性震顫(CT)、增生性壞死性肺炎(PNP)和腸炎等[3-4]。單獨(dú)Mhyo或PCV2感染并不足以引起疾病的臨床表現(xiàn)，但是并發(fā)或繼發(fā)其他細(xì)菌或病毒感染時(shí)，可使死亡率大大提高。

Mhyo與PCV2之間存在協(xié)同感染，Mhyo可以增強(qiáng)PCV2相關(guān)性肺損傷的嚴(yán)重性，增加PCV2在組織中的數(shù)量和分布[5]。對(duì)4周齡的斷奶仔豬進(jìn)行Mhyo攻毒，6周齡時(shí)再用PCV2攻毒，結(jié)果豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的呼吸道疾病，血清中PCV2 的拷貝數(shù)顯著上升, 病毒血癥持續(xù)期延長(zhǎng)，肺組織和淋巴組織的病理?yè)p傷比單獨(dú)Mhyo或PCV2感染時(shí)嚴(yán)重[6]。

迄今為止，對(duì)病原之間共感染的研究比較多，但是對(duì)聯(lián)苗各抗原之間的相互作用研究甚少。本研究用3組相同Mhyo抗原含量、不同PCV2抗原含量的圓支二聯(lián)疫苗和1組相同Mhyo抗原含量的單苗分別免疫BALB/c小鼠、新西蘭大耳白兔和健康仔豬，測(cè)定血清中PCV2抗體和Mhyo抗體，并在仔豬二免后進(jìn)行Mhyo強(qiáng)毒攻擊，觀察肺部病變程度，闡明PCV2與Mhyo抗原之間的免疫協(xié)同關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株、毒株和細(xì)胞

Mhyo HN0613株(代次F6)和PCV2 SH株，PK15-B1克隆細(xì)胞，均由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司鑒定并保存。

1.2 主要試劑

MEM干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco Invitrogen公司；Friis培養(yǎng)基由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA),購(gòu)自 Sigma Aldrich 公司；無(wú)水硫代硫酸鈉購(gòu)自Alfa Aesar 公司；β-丙內(nèi)酯購(gòu)自Serva公司；豬支原體肺炎ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 IDEXX 公司；PCV2抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BioChck公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工公司；Mhyo微量間接血凝(IHA)檢測(cè)試劑盒由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

16～18 g健康雌性BALB/c小鼠，PCV2 ELISA抗體陰性(效價(jià)<1∶50)；1～1.5 kg新西蘭大耳白兔，Mhyo IHA抗體陰性(效價(jià)<1∶5)；21日齡健康仔豬，PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原陰性，PCV2、Mhyo ELISA母源抗體陰性。

1.4 Mhyo菌液的制備及滅活

Mhyo HN0613株F6代凍干菌種用2 mL Friis培養(yǎng)基溶解，以10%比例接種于含20 mL Friis培養(yǎng)基的100 mL鹽水瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至pH=6.7～6.8時(shí)收獲。收獲的菌液以5%比例接種于含400 mL Friis培養(yǎng)基的三角瓶中，120 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，待pH值下降到6.7～6.8時(shí)收獲。收獲菌液測(cè)定顏色變化單位(CCU)。

向Mhyo菌液中加入過(guò)濾除菌的0.1 mol/L的BEI溶液，使終濃度為4 mmol/L，37℃恒溫振蕩24 h后加入終濃度為10 mmol/L的硫代硫酸鈉溶液，37 ℃恒溫振蕩1 h終止滅活。取1 mL滅活菌液接種50 mL Friis液體培養(yǎng)基進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)5 d后再取0.5 mL培養(yǎng)物移植到4.5 mL Friis液體培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)觀察10 d。

1.5 PCV2病毒液的制備及滅活

從細(xì)胞庫(kù)中取出凍存的PK15-B1克隆細(xì)胞復(fù)蘇，加入含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液，置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。當(dāng)其長(zhǎng)成良好單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按1∶2～1∶3比例傳代增殖培養(yǎng)。將擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞接種到細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶中，轉(zhuǎn)速為10～12 r/h，置36～37 ℃培養(yǎng)24～48 h。當(dāng)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞形成良好單層時(shí)，按1∶2～1∶3比例傳代繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)1次，待轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞形成良好單層時(shí)，按5%接種PCV2 SH毒種，置37 ℃下吸附30 min，加入細(xì)胞維持液，置37 ℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為10～12 r/h，每日觀察1～2次，細(xì)胞應(yīng)生長(zhǎng)良好，37 ℃下培養(yǎng)4 d，置-20 ℃下反復(fù)凍融2～3次，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并留樣作病毒含量測(cè)定。

向PCV2病毒液中加入終濃度0.1%的β-丙內(nèi)酯，4 ℃振蕩滅活30 h，37 ℃恒溫振蕩水解2 h。取少量滅活病毒液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，即少量病毒液接種已長(zhǎng)成單層的PK15-B1克隆細(xì)胞，置37 ℃下吸附1 h，棄去病毒液，加入新的細(xì)胞維持液，置37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 d，應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)盲傳3代后，用免疫熒光法(IFA)檢測(cè)。

1.6 PCV2病毒液的濃縮及Western blot檢測(cè)

PCV2滅活抗原經(jīng)300 kDa的中空纖維膜超濾柱分別進(jìn)行2倍和3倍濃縮。濃縮后的抗原進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳結(jié)束后將未染色的凝膠、裁減好的NC膜夾于濾紙之間，按照負(fù)極-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-正極的順序放入裝有電轉(zhuǎn)液的電泳槽，200 mA恒流轉(zhuǎn)印80 min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，NC膜放入麗春紅染色液中染色1～2 min，PBS洗去麗春紅染液。NC膜清洗干凈后，放入5%脫脂乳PBS中4 ℃過(guò)夜封閉，TBST洗滌2次。加入1∶1 000稀釋的3E5單抗(PCV2單抗，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院制備)，室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，再加入1∶2 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色10 s～1 min，化學(xué)發(fā)光儀顯影0.5～20 s，拍照。

1.7 滅活疫苗的制備

未經(jīng)濃縮的PCV2抗原、濃縮2倍和3倍的PCV2抗原分別與Mhyo抗原以5∶4比例混勻，低速攪拌10 min，再與Gel佐劑(Seppic公司)以9∶1的比例混合，低速攪拌20 min，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.3，分裝，每瓶20 mL。

生理鹽水與Mhyo抗原以5∶4比例混勻，再與Gel佐劑以9∶1比例混合，低速攪拌20 min，配制1組只含Mhyo抗原的疫苗。疫苗各組分見(jiàn)表1，配制的疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

表1 滅活疫苗組別及各組分用量

1.8 替代動(dòng)物免疫及血清抗體水平檢測(cè)

1.8.1 BALB/c小鼠免疫及血清抗體ELISA檢測(cè)

選取16～18 g PCV2 ELISA抗體陰性(效價(jià)低于1∶50)的健康雌性BALB/c小鼠25只，隨機(jī)分成5組，每組5只。第1～4組分別皮下接種豬支原體肺炎單苗，圓支二聯(lián)疫苗1、2和3，每只0.2 mL，14 d后按相同途徑和劑量進(jìn)行二免；第5組不接種，作為空白對(duì)照。各組小鼠均隔離飼養(yǎng)、觀察。二免后21 d采血，分離血清，用自制的小鼠血清間接ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中的PCV2 ELISA抗體效價(jià)。

1.8.2 家兔免疫及血清抗體IHA測(cè)定

1～1.5 kg Mhyo IHA抗體陰性(效價(jià)低于1∶5)的健康新西蘭大耳白兔25只，隨機(jī)分成5組，每組5只。第1～4組每只后腿肌肉注射豬支原體肺炎單苗，圓支二聯(lián)疫苗1、2和3，每只0.5 mL，第5組不免疫，作空白對(duì)照。免疫后28 d采血，分離血清，測(cè)定兔血清中Mhyo IHA抗體效價(jià)。

1.9 本體動(dòng)物免疫、攻毒、血清抗體及PCV2抗原檢測(cè)

1.9.1 仔豬免疫及攻毒

25頭21日齡健康易感仔豬隨機(jī)分成5組，每組5頭。第1～4組分別頸部肌肉注射豬支原體肺炎單苗，圓支二聯(lián)疫苗1、2和3，每頭豬注射1頭份(2 mL)，第5組每頭注射不含抗原成分、只由培養(yǎng)液和佐劑配制的安慰劑2 mL，作為攻毒對(duì)照組。疫苗接種組及攻毒對(duì)照組首免后14 d加強(qiáng)免疫1次，免疫劑量為2 mL/頭。二免后28 d，所有試驗(yàn)組豬氣管注射Mhyo濟(jì)南系強(qiáng)毒10 mL(含100個(gè)最小發(fā)病劑量)，連續(xù)觀察28 d，剖殺取肺。

1.9.2 仔豬血清抗體檢測(cè)

所有仔豬在首免當(dāng)天接種前及首免后14 d(二免接種前)、28 d、42 d(攻毒前)、56 d、70 d(剖殺前)分別采血，分離血清，Mhyo血清抗體采用 IDEXX間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和自制的微量間接血凝檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，PCV2血清抗體采用BioChek 間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.9.3 仔豬攻毒后肺部病變情況

Mhyo濟(jì)南系強(qiáng)毒攻擊后28 d剖殺所有試驗(yàn)豬，按照28分法對(duì)試驗(yàn)豬的肺炎病變進(jìn)行評(píng)分[7]。分別對(duì)免疫組豬和對(duì)照組豬進(jìn)行打分，按照以下公式計(jì)算肺部病變減少率：

1.9.4 仔豬血清及肺組織PCV2 抗原檢測(cè)

所有仔豬首免后14、28、42、56、70 d采血分離的血清，70 d剖殺時(shí)采集的肺組織按照Ezup 柱式病毒 DNA 抽提試劑盒操作步驟提取 DNA，用PCV2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：PCV2-F：5′-TTC GGT ACC AGC TAT GAC GTA TCC AAG-3′，PCV2-R：5′-GCC AAG CTT TCA CTT CGT AAT GGT TTT-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mhyo菌液的制備及滅活

收獲的Mhyo菌液CCU測(cè)定結(jié)果為109CCU/mL，經(jīng)終濃度4 mmol/L BEI滅活24 h后進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，2次培養(yǎng)物均不變色，說(shuō)明滅活徹底。

2.2 PCV2病毒液的制備及滅活

收獲的PCV2病毒液含量為106.5TCID50/mL，少量滅活病毒液接種PK15-B1克隆細(xì)胞連續(xù)盲傳3代，IFA法檢測(cè)無(wú)綠色熒光著染的PCV2陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明病毒液滅活徹底。

2.3 PCV2病毒液的Western blot檢測(cè)

未經(jīng)濃縮的PCV2滅活抗原，經(jīng)中空纖維膜濃縮2倍、3倍的滅活抗原同時(shí)進(jìn)行Western blot檢測(cè)，在27 kDa左右有條帶，說(shuō)明有明顯的免疫反應(yīng)性，并且條帶隨著濃縮倍數(shù)的增加而變粗，見(jiàn)圖1。

2.4 小鼠血清PCV2抗體ELISA檢測(cè)

5個(gè)試驗(yàn)組的小鼠全部采血并分離血清，用自制的小鼠血清間接ELISA試劑盒測(cè)定血清中PCV2抗體效價(jià)。同稀釋度待檢血清OD450 nm值/陰性血清OD450 nm值(P/N值)不低于2.1時(shí)判為陽(yáng)性，以P/N值不低于2.1的血清最大稀釋度作為該血清的ELISA抗體效價(jià)。小鼠血清中PCV2 ELISA抗體效價(jià)不高于1∶50，判為陰性；高于1∶50，判為陽(yáng)性。小鼠血清PCV2 ELISA抗體效價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可以看出，豬支原體肺炎單苗組與空白對(duì)照組PCV2抗體均呈陰性，圓支二聯(lián)疫苗1、2和3免疫小鼠產(chǎn)生的PCV2抗體效價(jià)隨著圓環(huán)病毒含量的增加而增加。

M.預(yù)染Marker；1.濃縮3倍的PCV2抗原；2.濃縮2倍的PCV2抗原；3.不濃縮的PCV2抗原

表2 小鼠血清PCV2 ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果

2.5 兔血清Mhyo IHA抗體效價(jià)測(cè)定

5個(gè)試驗(yàn)組的兔子全部采血并分離血清，用IHA測(cè)定血清中Mhyo抗體效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可以看出，空白對(duì)照組Mhyo抗體為陰性，豬支原體肺炎單苗組平均效價(jià)為1∶88，相同Mhyo含量、不同PCV2含量的圓支二聯(lián)疫苗1、2和3免疫兔子產(chǎn)生的Mhyo抗體效價(jià)隨著PCV2含量的增加而提高，這說(shuō)明PCV2全病毒可能對(duì)Mhyo的免疫有增強(qiáng)作用。

表3 兔血清Mhyo IHA抗體測(cè)定結(jié)果

2.6 仔豬血清抗體檢測(cè)

仔豬血清PCV2抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，從表4可以看出圓支二聯(lián)疫苗3在首免后14 d PCV2抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，在首免后56 d達(dá)到高峰，首免后70 d開(kāi)始下降；圓支二聯(lián)疫苗1和圓支二聯(lián)疫苗2在首免后28 d(即二免后14 d)PCV2抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，在首免后42 d 至70 d PCV2抗體處于一個(gè)穩(wěn)定期；豬支原體肺炎單苗組和攻毒對(duì)照組在整個(gè)檢測(cè)期間PCV2抗體均呈陰性。綜合各組PCV2抗體水平結(jié)果，說(shuō)明疫苗中PCV2抗原含量越高，豬PCV2血清抗體越早轉(zhuǎn)化成陽(yáng)性，且達(dá)到的抗體水平也越高。

仔豬血清Mhyo ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5，從表中可以看出所有免疫組在首免后28 d(即二免后14 d) Mhyo抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，且抗體在持續(xù)上升，首免42 d采血結(jié)束后進(jìn)行Mhyo強(qiáng)毒攻擊，攻毒后所有組別Mhyo抗體水平在上升，攻毒對(duì)照組在攻毒后28 d抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。免疫組別中，隨著疫苗中PCV2抗原含量的增加，免疫后Myho抗體水平也在提高，說(shuō)明PCV2抗原對(duì)Mhyo抗體的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。

表4 仔豬血清PCV2 ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果(S/P值)

表5 仔豬血清Mhyo ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果(S/P值)

仔豬血清Mhyo IHA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6，從表中可以看出IHA檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果基本一致，只有首免后28 d Mhyo抗體有所差別，豬支原體肺炎單苗組和圓支二聯(lián)疫苗1組首免后28 d(即二免后14 d)Mhyo抗體效價(jià)>1∶5，可疑；圓支二聯(lián)疫苗2組和圓支二聯(lián)疫苗3組 Mhyo抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，大于1∶10。Mhyo IHA檢測(cè)結(jié)果同樣說(shuō)明PCV2抗原對(duì)Myho抗體的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。

表6 仔豬血清Mhyo IHA抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

2.7 仔豬肺部病變情況

Mhyo濟(jì)南系強(qiáng)毒攻擊后，采用28分法評(píng)分，結(jié)果如下：攻毒對(duì)照組肺部病變平均得分最高，為12.8，豬支原體肺炎單苗組、圓支二聯(lián)疫苗1、2和3組肺部病變平均得分依次降低，肺部病變減少率依次升高，且圓支二聯(lián)疫苗2和圓支二聯(lián)疫苗3肺部病變減少率均在80%以上(結(jié)果見(jiàn)表7)。這說(shuō)明圓支二聯(lián)疫苗中PCV2抗原對(duì)Mhyo免疫有增強(qiáng)作用，且隨著PCV2全病毒抗原含量的增加，免疫保護(hù)效果隨之增強(qiáng)。部分豬的病變情況見(jiàn)圖2。

表7 各組肺部病變?cè)u(píng)分及肺部病變減少率

A.豬支原體肺炎單苗組; B.圓支二聯(lián)疫苗1組;C.圓支二聯(lián)疫苗2組;D.圓支二聯(lián)疫苗3組;E、F.攻毒對(duì)照組，其中：箭頭指示有病變的地方

2.8 仔豬血清及肺組織PCV2抗原檢測(cè)

所有仔豬首免后14、28、42、56和70 d采血分離的血清，70 d剖殺時(shí)采集的肺組織用PCV2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有血清及肺組織樣品在751 bp處均沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶(部分血清及肺組織PCR結(jié)果見(jiàn)圖3)，這說(shuō)明在仔豬的整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中未受到野毒PCV2的感染。

M.Marker；+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照；1～5.豬支原體肺炎單苗組;6～10.圓支二聯(lián)疫苗1組;11～15.圓支二聯(lián)疫苗2組;16～20.圓支二聯(lián)疫苗3組;21～25.攻毒對(duì)照組

3 討論

在前期研究中，用Mhyo抗原含量相同、PCV2抗原含量不同的2組圓支二聯(lián)疫苗免疫新西蘭大耳白兔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)圓環(huán)病毒經(jīng)過(guò)中空纖維濃縮后含量高的圓支二聯(lián)疫苗組Mhyo抗體效價(jià)更高，且同樣經(jīng)過(guò)中空纖維濃縮，不含圓環(huán)病毒抗原的MEM培養(yǎng)基與不含Mhyo抗原的Friis培養(yǎng)基配制的疫苗，免疫后未檢測(cè)到Mhyo抗體；Mhyo抗原含量高、圓環(huán)病毒含量低和Mhyo抗原含量低、圓環(huán)病毒含量高的2組圓支二聯(lián)疫苗免疫新西蘭大耳白兔，結(jié)果后者免疫后產(chǎn)生的Mhyo抗體效價(jià)反而比前者免疫后產(chǎn)生的抗體效價(jià)高。由這2個(gè)試驗(yàn)結(jié)果猜測(cè)PCV2全病毒可能對(duì)Mhyo免疫具有促進(jìn)作用，因此設(shè)計(jì)本研究進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，PCV2全病毒對(duì)Mhyo的免疫具有促進(jìn)作用，這可能與PCV2基因組內(nèi)含有的CpG基序(CpG-寡聚脫氧核苷酸序列，簡(jiǎn)稱CpG-ONG)有關(guān)。PCV2基因組中至少含有18個(gè)CpG基序，并且在豬外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)物中能誘導(dǎo)IFN-α 的產(chǎn)生[8]。在體外條件下，利用與PCV2不相關(guān)的CpG-ONG序列也能誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-10或γ干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生[9]。Opriessnig等[6]在研究Mhyo與PCV2之間的關(guān)系時(shí)，得到了類似的結(jié)果，即先后感染Mhyo和PCV2的豬產(chǎn)生的Mhyo血清ELISA抗體水平顯著高于只感染Mhyo的豬產(chǎn)生的ELISA抗體水平。

另外，Yim等[10]發(fā)現(xiàn)支氣管敗血波氏桿菌抗原對(duì)Mhyo的免疫也具有促進(jìn)作用，接種支氣管敗血波氏桿菌抗原和Mhyo抗原的小鼠產(chǎn)生的Mhyo特異性IgG高于只接種Mhyo抗原小鼠產(chǎn)生的特異性IgG。Thacker等[11-12]揭示了Mhyo與PRRSV、豬流感病毒(SIV)發(fā)生共感染時(shí)可以增加Mhyo抗體水平。這些結(jié)果提示了Mhyo聯(lián)苗的免疫效果可能優(yōu)于豬支原體肺炎單苗。