張則，鄭陽，郝珊珊，蔡佳希，馮秀麗

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物細菌學(xué)重點實驗室/教育部“動物健康與食品安全”國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 南京 210095)

法氏囊(bursa of fabricius,BF)是禽類特有的體液免疫中樞器官，是B細胞發(fā)育成熟和抗體產(chǎn)生的組織器官，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。T淋巴細胞起源于骨髓中的造血干細胞，隨后T細胞轉(zhuǎn)移到胸腺中成熟，既參與細胞免疫又參與體液免疫，在產(chǎn)生抗體過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是免疫系統(tǒng)中不可缺少的重要組成部分[1]。目前法氏囊對T細胞的作用機制仍需進一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，法氏囊組織滅活疫苗在體內(nèi)保護效果優(yōu)于胚苗和細胞苗[2]，暗示著其存在某種活性成分可以促進免疫反應(yīng)。據(jù)Murthy等[3]報道，大劑量的法氏囊組織提取物在體外可以促進植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)的淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，說明其能夠不依賴于機體在體外也能發(fā)揮良好的免疫功能。Audhya等[4]在1986年首次從雞法氏囊組織中分離出一種名為囊素三肽的生物肽，到現(xiàn)在為止，已經(jīng)從法氏囊中發(fā)現(xiàn)多種活性肽，如BP5[5]、BSP-Ⅱ[6]和 BPP-Ⅱ[7]，并證實其能夠參與調(diào)節(jié)B細胞發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)過程[7-9]。探究法氏囊活性肽的免疫學(xué)功能和作用機理，為開發(fā)其臨床應(yīng)用潛力提供新的思路。

法氏囊活性肽BP7和BP9是本實驗室近期研究的2種生物活性分子，已在小鼠免疫試驗中證實其能夠增強禽流感病毒(AIV)滅活疫苗的免疫效果[10-11]。然而，對法氏囊活性肽BP7和BP9如何調(diào)節(jié)T細胞的作用機制報道甚少?；诖?，本研究以AIV滅活疫苗免疫小鼠為模型，開展了多肽調(diào)節(jié)T淋巴細胞作用的試驗，為探究法氏囊活性肽調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

法氏囊活性肽BP7(氨基酸序列為GGCDGAA)和BP9(氨基酸序列為LMTFRNEGT)均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，純度在98%以上；禽流感病毒株A/chicken/Shandong/LY1/2017 (H9N2) 為本實驗室保存。

HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗購自聯(lián)科生物公司；單組分TMB顯色液、ELISA終止液均購自善清博生物公司；牛血清蛋白(BSA)、噻唑蘭、DMSO均購自于上海生物生工公司；CD3+T細胞陰選磁珠購自優(yōu)寧維生物公司；CD3-FITC、CD8-PE、CD4-Alex Fluro流式抗體和FITC/PI 凋亡檢測試劑盒均購自美國BD公司；白細胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)ELISA試劑盒購自武漢基因美生物公司。

1.2 H9N2抗原疫苗的制備

選取純化后病毒H9N2作為疫苗抗原，根據(jù)《獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》制備H9N2亞型禽流感滅活疫苗，油包水劑型，穩(wěn)定無析出，黏度合格，無菌。

1.3 小鼠免疫和H9N2病毒抗體檢測

6周齡SPF級ICR小鼠(購自揚州大學(xué)實驗動物中心)隨機分為PBS組和疫苗組，每組10只。疫苗腹腔注射小鼠，100 μg/只，于一免后14 d二免，7 d后三免， 1周后采集小鼠血清，以2 μg/mL的純化AIV滅活抗原包被酶標(biāo)板，建立間接ELISA方法[10]，檢測其H9N2亞型禽流感病毒的特異性抗體效價。

1.4 脾臟淋巴細胞懸液的制備

將小鼠斷頸處死，75%酒精浸泡5 min，無菌摘取脾臟，用注射器活塞在200目尼龍布研磨過濾，加入適量的PBS稀釋，沿著管壁緩慢滴加在等體積的淋巴細胞分離液上，500g離心20 min，小心吸取淋巴細胞層，加入過量的無菌PBS清洗2次，調(diào)整細胞懸液濃度至1×107個/mL，靜置備用。

1.5 磁珠篩選T細胞及純度檢測

將上述制備好的細胞懸液，加入適量的磁珠抗體，冰上孵育15 min，用5 mL buffer洗滌細胞，300g離心7 min，棄去上清。之后加入適量的磁珠，充分混勻，4 ℃孵育30 min。然后加入1 mL buffer并轉(zhuǎn)移至流式管中，放置在磁力架上6～8 min，重復(fù)分選2次，吸取上清，離心，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞。取少量的細胞懸液計數(shù)，加入5 μL的CD3-FITC標(biāo)記抗體，避光孵育30 min，500 μL PBS重懸，流式細胞儀鑒定細胞純度。

1.6 T細胞增殖檢測

取一部分分選后的細胞懸液，加入到96孔細胞板中(105細胞/孔)。將劑量為10 ng/mL刀豆素ConA分別與BSA、BP7和BP9混勻，刺激T細胞。細胞分組為：Con組為空白對照組，ConA組為刀豆素ConA+BSA刺激組(劑量為1 ng/mL)，ConA+BP7組為刀豆素ConA+多肽BP7(劑量為1 ng/mL)刺激組，ConA+BP9組為刀豆素ConA+多肽BP9(劑量為1 ng/mL)刺激組，并在作用48 h后，按照標(biāo)準(zhǔn)的MTT方法檢測2種法氏囊活性肽對T細胞活力的影響[12]。

1.7 T細胞亞型分化鑒定

取分選后的T細胞懸液，加入到六孔板中，設(shè)立與上述相同的分組，用含有10%胎牛血清的PRMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h和48 h后，離心收集細胞，加入CD3-FITC、CD8-PE、CD4-Alex Fluro流式抗體，充分混勻，常溫避光孵育30 min，PBS清洗2次，500 μL PBS重懸，流式細胞儀上機鑒定。

1.8 T細胞早期凋亡分析

取分選后的T細胞懸液，加入到六孔板中，設(shè)立上述相同的分組，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12、24和48 h后，離心收樣，加入Annexin V-FITC 和 PI 染液，室溫避光標(biāo)記15 min，在1 h內(nèi)通過流式細胞分析儀，上機分析。

1.9 細胞因子檢測

收集培養(yǎng)48 h后96孔板中的細胞上清，-20 ℃分裝保存。按說明書操作，應(yīng)用商品化的ELISA試劑盒檢測IL-4和IFN-γ細胞因子含量變化情況。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均由Excel進行統(tǒng)計后，Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用t檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠的抗體水平

分別于一免和三免后2周采集免疫小鼠血清，利用間接ELISA方法檢測小鼠特異性抗體水平的變化。如圖1所示，免疫小鼠在三免后AIV的特異性抗體水平較對照組明顯升高，其OD值達到了0.607，且遠高于一免后AIV的抗體水平。該結(jié)果說明免疫小鼠已產(chǎn)生良好的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

2.2 BP7和BP9對CD3+T細胞增殖的促進作用

為了檢測法氏囊活性肽對T細胞增殖的影響，首先采用磁珠陰選T細胞，流式分析發(fā)現(xiàn)，磁珠篩選的免疫小鼠脾臟T細胞效果較好(圖2A)，CD3+陽性T細胞占篩選T細胞的比例高達95.6%(圖2B)。如圖2C所示，與ConA組相比，ConA+BP7組和ConA+BP9組的T細胞的OD值明顯升高，其中ConA+BP7組T細胞的OD值最高(P<0.01)。該結(jié)果說明，法氏囊活性肽BP7和BP9均促進CD3+T細胞增殖，且BP7促進T細胞活性的能力高于BP9。

注：**表示差異極顯著(P<0.01)

A.淋巴細胞；B.T細胞比例；C.CD3+T細胞增殖，其中：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 BP7和BP9對T細胞亞型分化的調(diào)節(jié)作用

2.3.1 BP7和BP9對CD3+CD4+T細胞分化的影響

法氏囊多肽BP7和BP9刺激磁珠篩選的免疫小鼠T細胞，然后流式細胞術(shù)進行檢測CD3+CD4+T細胞比例。結(jié)果如圖3A所示，在24 h和48 h時，與ConA組相比，ConA+BP7刺激組的CD3+CD4+T細胞比例均明顯升高(P<0.05)，不過ConA+BP9刺激組的CD3+CD4+T細胞比例與ConA組差異不明顯(P>0.05)，說明試驗劑量的BP7促進了T細胞向CD3+CD4+T細胞分化，而BP9不能活化T細胞增殖分化成CD3+CD4+T細胞，其功能機制還有待于進一步探索。

A.CD3+CD4+T細胞；B.CD3+CD8+T細胞

2.3.2 BP7和BP9對CD3+CD8+T細胞分化的影響

法氏囊多肽BP7和BP9刺激經(jīng)磁珠篩選的免疫小鼠T細胞，然后流式細胞術(shù)檢測CD3+CD8+T細胞比例。結(jié)果如圖3B所示，在48 h時，與ConA組相比，ConA+BP7組的CD3+CD8+T細胞比例升高，且ConA+BP9組的CD3+CD8+T細胞比例也升高，不過沒有達到顯著差異水平(P>0.05)。而在24 h時，ConA+BP7和ConA+BP9組與ConA組相比，CD3+CD8+T細胞比例變化不大，說明多肽BP7的刺激能夠促進活化T細胞增殖分化成CD3+CD8+T細胞，多肽BP9的刺激能一定程度上活化T細胞增殖分化成CD3+CD8+T細胞。

2.4 BP7和BP9抑制T細胞的早期凋亡

法氏囊多肽BP7和BP9刺激經(jīng)磁珠篩選的免疫小鼠T細胞，分別在12、24和48 h采用流式細胞術(shù)檢測T細胞凋亡情況，分析結(jié)果如圖4所示，ConA+BP7組在12、24和48 h里的早凋細胞比例分別為9.86%、7.60%和15.50%，比同一時間的空白對照組Con、ConA組的早凋細胞比例減少，差異較為明顯；ConA+BP9組在12、24和48 h里的早凋細胞比例分別為9.76%、13.25%和17.85%，也比同一時間的空白對照組Con、ConA組的早凋細胞比例少，差異也較為明顯。以上結(jié)果表明多肽BP7、BP9能在48 h內(nèi)一定程度上抑制T淋巴細胞的凋亡。

A.T細胞早期凋亡的流式細胞術(shù)結(jié)果；B. T細胞早期凋亡情況，其中：*、 ^、#分別表示在12、24和48 h時，ConA+BP7組、ConA+BP9組與ConA組相比差異顯著(P<0.05)

2.5 BP7和BP9對脾臟T淋巴細胞中細胞因子IL-4和IFN-γ表達水平的影響

通過ELISA試劑盒檢測細胞上清中的IFN-γ、IL-4的表達水平，如圖5所示，與Con和ConA組相比，ConA+BP7組能顯著提高Th1型細胞因子IFN-γ(80.796 ng/mL)和Th2型細胞因子IL-4(159.205 ng/mL)水平，差異極顯著(P<0.01)；而ConA+BP9組Th1型細胞因子IFN-γ(33.175 ng/mL)和Th2型細胞因子IL-4的含量(42.675 ng/mL)與Con和ConA組相比差異均不顯著。說明BP7能夠上調(diào)Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4的分泌水平，有明顯的活化作用。

圖5 CD3+T淋巴細胞上清IFN-γ和IL-4表達水平

3 討論

法氏囊是禽類唯一的體液中樞免疫器官，在免疫系統(tǒng)中占有重要地位，不僅參與體液免疫的調(diào)節(jié)，還參與調(diào)節(jié)細胞免疫[13]。以往的研究主要集中法氏囊活性肽對B細胞功能研究，對活性肽調(diào)節(jié)T細胞的報道很少，法氏囊活性肽調(diào)節(jié)T細胞的作用機制還尚不清楚。

本研究對BP7和BP9對T細胞的免疫調(diào)節(jié)活性進行驗證。選擇了1 ng/mL的BP7和BP9分別混合刀豆素Con A刺激磁珠分選小鼠T淋巴細胞，以檢測法氏囊活性肽對T細胞功能影響。研究結(jié)果表明，BP7和BP9均能增強T細胞增殖活性。淋巴細胞亞群中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞是衡量機體細胞和體液免疫功能的金標(biāo)準(zhǔn)，了解體內(nèi)免疫功能的主要途徑是通過淋巴細胞亞群的檢測[14]。本文以CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞為機體細胞和體液免疫功能的觀察指標(biāo),動態(tài)觀察多肽對T細胞功能影響。結(jié)果顯示， BP7和BP9對 CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞亞型免疫調(diào)節(jié)活性略有差異。BP7和BP9能夠同時促進 CD3+CD4+T分化，BP7在48 h能夠促進CD3+CD8+T細胞的分化，而BP9對CD3+CD8+T細胞無顯著影響，說明法氏囊活性肽BP7和BP9可能以不同的作用機制通過影響T細胞分化來調(diào)節(jié)細胞免疫反應(yīng)。

細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式, 它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，對維持個體正常生理過程和功能表達具有重大的生物學(xué)意義[15]。為此，本研究使用Annexin V-FITC/PI法檢測T細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，加入BP7和BP9刺激，T細胞的早期凋亡率明顯下降，由此得知，BP7和BP9與細胞的凋亡相關(guān)，隨著時間增加，T細胞的早期凋亡率有所上升，表明法氏囊活性肽BP7和BP9可能通過調(diào)節(jié)基因的表達來調(diào)控T淋巴細胞的分化成熟。Th1 細胞產(chǎn)生IFN-γ，而 Th2 細胞分泌IL-4。Th1、Th2 細胞分泌的細胞因子可共同調(diào)控細胞的分化與成熟。IL-4和IFN-γ是由激活的 T 細胞產(chǎn)生，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[16-17]。法氏囊活性肽BP7能夠上調(diào)IL-4和IFN-γ的細胞因子反應(yīng)，而BP9對細胞因子反應(yīng)無顯著影響，說明BP7和BP9對T細胞的作用機制不同，但其差異仍需進一步研究。

綜上所述，法氏囊活性肽BP7和BP9能夠通過不同作用方式促進T細胞的增殖分化，并可能通過調(diào)控基因表達來影響T細胞生物學(xué)功能活性，為深入挖掘法氏囊活性肽在免疫系統(tǒng)中的作用機制提供了參考。