肖璐，謝晶，于吉鋒，廖黨金，曹冶，林毅，李興玉，潘夢，葉健強，葉勇剛，康潤敏

(四川省畜牧科學(xué)研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

奶牛乳房炎是影響全球奶業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，奶牛乳房炎是由微生物感染、物理或化學(xué)刺激等因素引起的奶牛乳房乳腺組織的炎癥反應(yīng)。據(jù)報道與統(tǒng)計，全世界約有1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎，有30%的奶牛在泌乳期間至少患1次臨床型乳房炎[1-2]。奶牛乳房炎可分為臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎(又稱隱性乳房炎)，該病的致病因素復(fù)雜、發(fā)病率高、治愈反復(fù)發(fā)病率高，由于病原微生物的入侵，影響奶牛乳腺健康，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降、乳品質(zhì)降低，困擾著奶牛業(yè)的經(jīng)濟效益與健康發(fā)展，給全球的奶牛產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3]。引發(fā)奶牛乳房炎的病原微生物包括：球菌、桿菌、支原體、真菌、酵母和病毒等，根據(jù)來源和傳播途徑可以分為：傳染型致病原和環(huán)境致病原，傳染型致病原主要包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和支原體等，環(huán)境型致病原主要包括大腸桿菌、乳房鏈球菌、克雷伯氏菌、綠膿桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、變形桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌、牛棒狀桿菌、真菌及酵母菌等[4]。研究表明導(dǎo)致臨床中奶牛乳房炎發(fā)生的致病菌以金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌為主，占到引起奶牛乳房炎發(fā)病率的80%～90%[5]，但不同地方導(dǎo)致奶牛乳房炎主要致病菌流行的趨勢也存在顯著性差異，且耐藥性也不盡相同[6-7]。在牛奶乳房炎的防治中，養(yǎng)殖戶為了最大程度地減少乳房炎帶來的經(jīng)濟損失，濫用和亂用抗生素十分嚴重，導(dǎo)致牛奶中殘留大量的抗生素，給食品安全和人體健康均造成了危害[8-9]，且已有報道指出奶牛乳房炎的防治已經(jīng)成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)中使用抗生素的主要原因[10-11]。乳房炎的發(fā)生與多種病原微生物相關(guān)，但乳房菌群之間存在某種共生、互生、競爭、寄生等關(guān)系，可通過宏基因組測序分析，直接獲取乳汁中的菌群信息。本研究利用16S rDNA擴增子測序技術(shù)對四川省成都市、眉山市和涼山州3個地區(qū)的10家養(yǎng)殖場的奶牛乳房炎乳汁和正常乳汁微生物菌群多樣性進行比較分析，分析兩者直接的菌群結(jié)構(gòu)差異，掌握四川省奶牛乳房炎流行主要致病菌，為針對性地使用抗生素、保障食品安全和人民健康提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年6月分別從眉山市洪雅縣、成都市青白江區(qū)、涼山州西昌市某規(guī)模化奶牛場隨機選擇健康奶牛(體細胞數(shù)<20萬/mL)共計20頭作為對照組；臨床型乳房炎發(fā)病奶牛(體細胞數(shù)>100萬/mL)共計15頭作為試驗組，樣品信息詳見表1。對奶牛乳房進行消毒后，以無菌EP管采集對照組和試驗組的各奶牛的新鮮乳汁，隨即將采集后的乳汁編號放入冰盒中低溫保存送往實驗室，其中正常奶牛乳汁編號為ZCY1～ZCY20，臨床乳房炎奶牛乳汁樣編號為RFY1～RFY15。

1.2 主要試劑

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、NEB Nextr?Ultra TMDNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒、高效高保真酶均購自New England Biolabs，普通瓊脂糖DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 樣品信息

1.3 乳汁中微生物總DNA提取

從無菌的EP管中取乳汁樣本200 μL按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明書提取乳汁中微生物總DNA，使用紫外分光光度儀(NanoDrop 2000)和瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA樣品的濃度與純度。

1.4 乳汁中微生物16S rDNA的V3-V4高變區(qū)擴增

選擇16S rDNA中的V3-V4區(qū)域作為目的片段進行擴增，引物序列為515F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′，806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并在上下游引物上分別添加不同的barcode。PCR反應(yīng)體系為30 μL：Phusion Master Mix(2×)15 μL，上下游引物(2 μmol/L) 3 μL，gDNA(1 ng/μL) 10 μL，H2O 2 μL；反應(yīng)程序：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度，選擇大小為400～450 bp的條帶，并回收純化目的片段送公司測序分析。

1.5 DNA文庫構(gòu)建和上機測序

使用NEBNext?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行DNA文庫建立，將構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用HiSeq進行上機測序，測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.6 測序信息分析

①對下機獲得的原始數(shù)據(jù)(raw tags)進行拼接、過濾得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean tags)，再經(jīng)過Qiime的Tags質(zhì)量控制流程和Tag去除嵌合體序列處理，最終獲得有效數(shù)據(jù)(effective tags)?；谟行?shù)據(jù)，利用Uprse v7.0.1001對有效數(shù)據(jù)進行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種分類分析，篩選出代表性O(shè)TUs序列，利用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析，獲得不同分類水平上物種信息和基于物種的豐度分布情況；②使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Alpha多樣性指數(shù)，獲得35個樣本菌群豐度和多樣性；③利用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，確定測序深度，選用wilcox檢驗對2個組Alpha多樣性指數(shù)組間進行差異分析。使用R vegan包的anosim函數(shù)進行Anosim分析，驗證2組組間菌落結(jié)構(gòu)的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義；④基于R軟件進行Metastats分析和Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法對各分類水平2組間物種豐度數(shù)據(jù)進行分析，篩選出2個組間存在顯著差異的菌群。分析結(jié)果用均用“平均值±標準差”來表示。

2 結(jié)果

2.1 乳房炎和正常奶牛乳汁樣本測序和OTU注釋

通過Illumina Highseq測序后35個樣本共獲得2 839 426個原始數(shù)據(jù)(表2)，經(jīng)過拼接、過濾、質(zhì)控和去除嵌合體后有1 697 422個有效數(shù)據(jù)進入后期數(shù)據(jù)分析，其中乳房炎乳汁組和正常乳汁組每個樣本分別獲得(51 438±6 613)和(44 577±4 058)個有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件對35個樣本中所有的有效數(shù)據(jù)進行聚類，以97%的一致性為原則將序列聚類成為OTUs。結(jié)果顯示：試驗組和對照組分別有(46 480±7 381)和(44 158±4 072)個有效數(shù)據(jù)被聚類到(1 509±488)和(249±243)個OTUs中。從表3可見，2個組有效數(shù)據(jù)注釋水平隨著物種分類等級的下降不斷減少，其中試驗組和對照組分別由61%和49%的有效數(shù)據(jù)能注釋到屬水平，而僅僅只有33%和42%的有效數(shù)據(jù)被注釋到種水平上。

表2 35個樣本測序數(shù)據(jù)和OTU聚類

表3 35個樣本注釋后在各分類的序列數(shù)目

2.2 乳房炎和正常奶牛乳汁樣本的多樣性分析

通過樣品的多樣性分析，可以反映樣品內(nèi)的細菌群落的豐富度和多樣性，由稀釋曲線可知當測序序列條數(shù)達到30 000時，稀釋曲線趨于平滑衍生，OUT的數(shù)目接近飽和，表明現(xiàn)在所獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)足夠反應(yīng)樣本菌群的多樣性情況，且試驗組和對照組35個樣本的覆蓋率(goods coverage)值均在0.99以上，兩者共同說明本次所測序分析的35個樣品微生物群落的檢測比率接近飽和，目前的測序量能夠覆蓋樣本中絕大部分物種。使用Qiime軟件計算獲得35個樣本的Alpha多樣性指數(shù)，通過2組樣品的觀測物種數(shù)(Observed species)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson index)、Chao1指數(shù)(Chao1)，文庫覆蓋度(Good’ coverage)見表4，經(jīng)過wilcox檢驗結(jié)果顯示：試驗組的觀測物種數(shù)值顯著高于對照組(P<0.05)，兩者相差6～7倍，說明患乳房炎組奶牛乳汁中含有的菌落種類的數(shù)目遠比健康奶牛乳汁組更加豐富；試驗組香農(nóng)和辛普森指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，說明2組菌落分布多樣性存在顯著差異；而從Chao1和ACE指數(shù)來看，試驗組也顯著高于對照組(P<0.05)，說明2組中菌群的豐度也存在顯著差異。

表4 35個樣本Alpha多樣性指數(shù)分析

2.3 乳房炎和正常奶牛乳汁樣本分組合理性分析

2組菌落結(jié)構(gòu)差異與組間結(jié)構(gòu)差異的相關(guān)性分析結(jié)果表明：2組樣品的相關(guān)系數(shù)(R值)為0.939(圖1)，該結(jié)果證明組間菌落結(jié)構(gòu)的差異顯著大于組內(nèi)菌落結(jié)構(gòu)的差異(P<0.001)，由此可知分組合理。

圖1 Anosim分析2組間菌落結(jié)構(gòu)差異分析

2.4 乳房炎和正常奶牛乳汁組間微生物菌群多樣性差異分析

利用Uprse v7.0.1001對有效數(shù)據(jù)進行OTUs聚類和物種分類分析表明：在門水平上，試驗組和對照組樣品中最為豐富的菌群均為：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，試驗組分別占樣品序列總數(shù)比例依次是：33%、31%、7.6%、6.8%，對照組占樣品序列總數(shù)的比例依次為： 61%、35%、1.9%、0.2%(圖2)。在屬水平上，鏈球菌屬(Streptococcus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)為試驗組最為豐富的微生物菌群，分別占樣品序列的7.6%、6.97%、4.25%，而乳球菌屬 (Lactococcus) 、不動菌屬 (Acinetobacter)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)則是正常乳汁組(對照組)最為豐富的微生物菌群，分別占樣品序列的32.3%、5.0%、1.62%(圖3)。

圖2 門水平上對照組和試驗組乳汁的菌落結(jié)構(gòu)

圖3 屬水平上乳汁的菌落結(jié)構(gòu)

Metastats分析和Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法對各分類水平2組間物種豐度數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示：2組間在門水平上有27個門的相對豐度存在顯著差異，其中除放線菌門 (Actinobacteria) 對照組的相對豐度顯著高于試驗組外(P<0.05)，其余26個菌門，包括變形菌門(Proteob-acteria)、厚壁菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chlo-roflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、棲熱鏈球菌門(Deinococcus-Thermus)、廣古菌門(Euryarchaeota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、螺旋體門(Spirochaetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、產(chǎn)氧光菌門(Oxyphotobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、黑水仙菌門(Melainabacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、Candidatus Yanofskybacteria、Kiritimatiellaeota、互養(yǎng)菌門(Syne-rgistetes)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、Calditrichaeota、Acetothermia、奇古菌門(Thaumarchaeota)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、衣原體門(Chlamydiae)、泉古菌門(Crenarchaeota)、Diapherotrites、Margulisbacteria、裝甲菌門(Armatimonadetes)，其在試驗組的相對豐度均顯著高于對照組(P<0.05)。

在屬水平上，2組有350個屬的相對豐度存在顯著性差異，其中有113個屬屬于變形菌門(Proteobacteria)，105個屬屬于厚壁菌門(Firmicutes)，48個屬屬于放線菌門(Actinobacteria)，45個屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，為2組相對分析顯著差異屬主要聚集的門。從2組中相對豐度差異最顯著的前20個屬中可見，對照組乳酸鏈球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和亞特蘭大桿菌屬(Atlantibacter)的相對豐度顯著性的高于試驗組(P<0.05)，而試驗組的鏈球菌屬(Streptococcus)、隱秘桿菌屬(Trueperella)、水棲菌屬(Enhydrobact-er)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、肉桿菌屬(Atopostipes)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、氣球菌屬 (Aerococcus)、Guggenheimella屬、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)、泰氏菌屬(Tissierella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、不活動粒菌屬(Ignavigranum)、費克藍姆氏菌屬(Facklamia)和Iamia屬的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)。

在種水平上，2組有213個種的相對豐度存在顯著性差異(P<0.05)。從2組相對豐度差異最顯著的前20個種中可見，對照組乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸桿菌(Lactobacillushelveticus)、約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、綠色氣球菌(Aeroeoccusviridans)和蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)的相對豐度顯著性高于試驗組，而試驗組的無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、nosocomialis不動桿菌(Acinetobacternosocomialis)、化膿隱秘菌(Trueperellapyogenes)、奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)、泡囊短波單胞菌(Brevundimonasvesicularis)、食竇魏斯氏菌(Weissella.cibaria)、丙桿菌(Caulobacter)、凝固酶陰性葡萄球菌(Staphylococcuspettenkoferi)、海迪茨氏菌(Dietziamaris)、乳微桿菌(Microbacteriumlacticum)、雙孢梭菌 (Clostridiumdisporicum)、結(jié)膜干燥棒狀桿菌(Corynebacteriumxerosis)、Piceasmithiana菌、塔氏不動桿菌(Acinetobactertowneri)、綠色氣球菌(Aerococcusviridans)和戴爾福特菌(Delftiatsuruhatensis)的相對豐度顯著性高于對照組(P<0.05)。

3 討論

奶牛乳房炎是全球公認的奶牛群體中最常見、治療費用最昂貴的疾病，給全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟損失，而我國的奶牛乳房炎發(fā)病情況更加嚴峻，嚴重制約了奶牛業(yè)的健康發(fā)展。奶牛乳房炎的病因非常復(fù)雜，病原繁多，有超過150種致病微生物可導(dǎo)致奶牛乳房炎的發(fā)生，較為常見的有20多種[11-13]。宏基因組學(xué)測序技術(shù)的出現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)微生物技術(shù)的局限性，使得很多難培養(yǎng)及含量低的細菌可以被測出，通過對正常與患乳房炎奶牛菌群結(jié)構(gòu)的研究，以期發(fā)現(xiàn)奶牛乳房炎與乳汁菌群之間可能存在的因果關(guān)系。本研究依托16S rDNA擴增子測序技術(shù)，對采自四川省奶牛主要養(yǎng)殖區(qū)成都、眉山、涼山州3地的10家奶牛場中的20份健康奶牛乳汁和15份乳房炎病牛乳汁進行了測序，橫向比較了患乳房炎病牛與正常奶牛乳汁之間的菌群差異，并分析患乳房炎病牛乳汁中的主要致病菌，探索奶牛乳房炎發(fā)生的微生物群落特征差異。

通過對四川省部分奶牛場生產(chǎn)中正常乳汁和乳房炎乳汁的微生物菌群的差異分析，發(fā)現(xiàn)2組菌群在門水平上有27個門的相對豐度存在顯著差異，在屬水平上有350個屬的相對豐度有顯著差異，在種水平上有213個種的相對豐度存在顯著性差異。從門的水平上看，曾學(xué)琴等[14]研究表明，乳房炎奶牛的牛奶中豐度排名前3的菌門依次是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門；Catozzi等[15]發(fā)現(xiàn)，患乳房炎奶牛的牛奶中排名前3的菌門依次為厚壁菌門、變性菌門、擬桿菌門；陶娜拉[16]分析發(fā)現(xiàn)，強陽及弱陽性乳房炎奶牛乳汁中的優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，其結(jié)果與本次調(diào)查結(jié)果不完全一致。四川地區(qū)患乳房炎奶牛的牛奶中排名前3的菌門依次為變形菌門、放線菌門及擬桿菌門。從豐度分布來看，在傳染型致病原中，四川地區(qū)患乳房炎奶牛與正常奶牛乳汁中存在顯著差異的致病菌為無乳鏈球菌、凝固酶陰性葡萄狀球、化膿隱秘菌和綠色氣球菌，而常見的金黃色葡萄球菌2組并無顯著差異；在環(huán)境型致病原中2組乳汁中凝固酶陰性葡萄狀球菌、化膿隱秘菌、綠色氣球菌豐度也出現(xiàn)了顯著升高。

葡萄球菌是引起奶牛乳房炎常見、重要病原，其中，金黃色葡萄球菌屬于凝固酶陽性菌，溶血性葡萄球菌、琥珀葡萄球菌則屬于凝固酶陰性菌。金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌作為奶牛乳房炎的主要致病菌，常常能從生產(chǎn)的乳汁中分離出，且金黃色葡萄球菌的陽性感染率通常會顯著高于無乳鏈球菌，因此金黃色葡萄是導(dǎo)致奶牛乳房炎的首要致病菌[17-18]。然而，在本研究中僅觀察到2組之間無乳鏈球菌存在豐度差異，而金黃色葡萄球菌的豐度不存在顯著差異，由此推測該地區(qū)乳房炎流行的主要致病菌為無乳鏈球菌。在環(huán)境性病菌的分析中發(fā)現(xiàn)，2組乳汁中凝固酶陰性葡萄球菌、化膿隱秘菌、綠色氣球菌豐度也出現(xiàn)了顯著性差異，由于凝固酶陰性葡萄球菌導(dǎo)致的乳房炎臨床癥狀不明顯，因此該菌常常不受重視，但近年來大量研究中乳房炎奶樣中分離獲得的凝固酶陰性葡萄球菌甚至已經(jīng)超過了金黃色葡萄球菌[19-20]，已成為許多國家奶牛乳房炎病原中的重要致病菌[21-22]?；撾[秘桿菌是一種條件致病菌，常寄生于健康牛的乳房中，當奶牛免疫機能低下時便可導(dǎo)致奶牛乳房化膿性感染，繼而引發(fā)乳房炎[23]。綠色氣球菌作為一種機會性致病菌，常分布于奶牛場環(huán)境和皮膚中，部分菌株被證實對小鼠乳腺具有很強的致病性，說明該菌可能對奶牛乳房炎的發(fā)生具有一定的影響[24]。

綜上，本試驗分析發(fā)現(xiàn)，四川地區(qū)10家養(yǎng)殖場中臨床型乳房炎奶牛和健康奶牛乳汁中無乳鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、化膿隱秘菌、綠色氣球菌呈現(xiàn)顯著差異，在奶牛乳房炎的防控中應(yīng)重點關(guān)注這4種菌的感染。本研究為四川地區(qū)奶牛乳房炎的防控提供參考，為健康牛的標準制定提供微生物指標參考。