吳許丹，吳月，陳艷，張錦，陳婧，胡家歡，龍?jiān)气P，姜焱*，周斌*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095;2. 南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京 210019)

豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的一種正鏈RNA病毒[1]。豬瘟一旦暴發(fā)，疫源地的養(yǎng)殖業(yè)及政府都苦不堪言，全球每年因豬瘟遭受的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以億計(jì)[2]。CSFV基因組是由兩端的非編碼區(qū)和位于中央的開放式閱讀框(open reading frame，ORF)組成[3]。該閱讀框編碼的多聚蛋白在蛋白酶的作用下被分解成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1和E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4B、NS4A、NS5A和NS5B)[4]。E0蛋白又稱為Erns蛋白，是CSFV的一種囊膜糖蛋白，由多聚蛋白上268位的Glu至494位的Ala之間的227個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量大小為44～48 kDa[5-6]。E0蛋白存在大量的抗原表位，能在病毒感染機(jī)體后誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的免疫應(yīng)答反應(yīng)?？衫肊0蛋白的初級(jí)抗原表位進(jìn)行鑒別診斷，特異性區(qū)分CSFV、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和邊界病病毒(border disease virus，BDV)感染[7]。我國(guó)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020)》中已經(jīng)明確將豬瘟的凈化列為重點(diǎn)任務(wù)。鑒于目前的豬瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫豬群后不能開展血清學(xué)鑒別診斷，不少豬場(chǎng)已經(jīng)開始采用新疆天康生物股份有限公司[8]或者武漢科前生物股份有限公司[9]生產(chǎn)的豬瘟病毒E2亞單位疫苗，免疫后可以引導(dǎo)豬群產(chǎn)生針對(duì)E2蛋白的抗體。但應(yīng)用檢測(cè)E2抗體的試劑盒無法區(qū)分豬群中是否存在野毒感染，因此可通過檢測(cè)E0蛋白的抗體確定豬群中是否存在野毒感染。本研究根據(jù)石門株E0基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因，插入原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了pET-28a-E0原核表達(dá)質(zhì)粒。誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的目的蛋白經(jīng)鑒定后進(jìn)行梯度稀釋，包被ELISA抗原板，通過多次優(yōu)化，建立了檢測(cè)CSFV E0抗體的ELISA方法，并檢測(cè)了臨床豬血清樣本，驗(yàn)證了此方法的臨床應(yīng)用效果，用于初步檢測(cè)或者鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體和血清樣本

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自北京莊盟生物科技有限公司；pET-28a原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)的E2蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟病毒石門株、豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬臨床血清樣本來自南京晟泰沅農(nóng)牧發(fā)展有限公司和新疆天康生物技術(shù)股份有限公司。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、Primer Star及T4 Ligase購(gòu)自大連寶生物科技有限公司(TaKaRa)；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo Scientific公司；6×His標(biāo)簽高親和力Ni純化柱購(gòu)自General Electric公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；IDEXX豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；MEDIAN/JBT豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 目的蛋白表達(dá)、純化與鑒定

1.3.1 目的基因獲取與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GenBank登錄的石門株(AF092448)E0全長(zhǎng)基因序列，用DNA STAR軟件設(shè)計(jì)1對(duì)E0全長(zhǎng)基因特異性引物(F：5′-TGACGGATCCATGGAAAA-TATAACTCAATGGAACCTGAGCG-3′,R：5′-TGACCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3′)，并引入BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。提取病毒RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并經(jīng)上述引物擴(kuò)增獲取目的基因。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的片段，雙酶切處理目的基因和pET-28a原核表達(dá)載體，純化后經(jīng)T4 Ligase酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α細(xì)胞，挑選單克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，序列正確的原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-E0。

1.3.2 目的蛋白表達(dá)、純化與鑒定

將成功構(gòu)建的質(zhì)粒pET-28a-E0克隆至大腸桿菌BL21細(xì)胞，挑選單克隆37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6時(shí)終止培養(yǎng)，4 ℃冰箱放置15 min。 再加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃搖床誘導(dǎo)5 h。離心分離上清和沉淀，超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE分析；分別以His標(biāo)簽抗體及標(biāo)準(zhǔn)豬瘟陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行Western blot鑒定。目的蛋白經(jīng)過大量表達(dá)并超聲破碎后，利用His標(biāo)簽鎳柱純化后用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度，備用。

1.4 E0抗體ELISA方法的建立

1.4.1 最佳抗原包被濃度和一抗血清稀釋倍數(shù)

在96孔板上用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和待測(cè)樣本最佳稀釋倍數(shù)，利用CBS溶液對(duì)已成功制備并測(cè)定濃度的E0蛋白進(jìn)行倍比稀釋(0.5、1、2和4 μg/mL)包被后4 ℃靜置過夜。次日用1×PBST洗滌4遍，每孔加入300 μL 1%的牛血清白蛋白(BSA)，37 ℃靜置封閉2 h。洗滌拍干，采用倍比稀釋的方法摸索最佳一抗孵育條件，第一行每孔加入100 μL PBST作為陰性對(duì)照，第2～7行加入100 μL 稀釋倍數(shù)分別為400、200、100、50、20、10和2倍的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，37 ℃孵育1 h。棄去板內(nèi)液體，PBST洗滌4遍，拍干。每孔加入100 μL羊抗豬IgG-HRP二抗，37 ℃孵育30 min。棄去板內(nèi)液體，PBST洗滌4遍，拍干。加入TMB顯色液，每孔100 μL 避光室溫顯色5～10 min，每孔加入50 μL終止液終止顯色，使用酶標(biāo)儀讀取OD值。按照常規(guī)方陣滴定法進(jìn)行結(jié)果分析，以陽(yáng)性、陰性孔OD值的比值即P/N值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)最佳抗原包被濃度和樣本最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行比較試驗(yàn)，確定最佳反應(yīng)條件。

1.4.2 最佳一抗血清孵育時(shí)間

按照已確定的最佳抗原包被濃度包被ELISA板，分別用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清樣本和陰性樣本，以最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋后每孔加入100 μL，設(shè)定20、30、45和60 min 4個(gè)時(shí)間段，每組3個(gè)重復(fù)。對(duì)4個(gè)不同一抗孵育時(shí)間的P/N結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳一抗孵育時(shí)間。

1.4.3 二抗最佳稀釋倍數(shù)

選擇標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清，按照已確定的孵育時(shí)間和稀釋倍數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，將羊抗豬IgG-HRP二抗分別進(jìn)行10 000、20 000、30 000、40 000和50 000倍稀釋，每組3個(gè)重復(fù)。根據(jù)每個(gè)稀釋倍數(shù)下3組重復(fù)的陰陽(yáng)性平均OD值計(jì)算P/N值，確定二抗最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.4 陰陽(yáng)性判定臨界值

挑選出30個(gè)陰性樣本，按照優(yōu)化后的包被和反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA檢測(cè)。計(jì)算30份樣本OD值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)。然后計(jì)算出X+2SD和X+3SD的值，確定陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)及可疑區(qū)間。

1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

1.4.6 特異性試驗(yàn)

分別選取PRRSV、PRV、PCV2陽(yáng)性血清和CSFV的陽(yáng)性及陰性血清作為一抗血清，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，按照優(yōu)化的包被和反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。計(jì)算每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)孔的平均OD值，判定本研究方法的特異性是否良好。

1.4.7 符合率測(cè)定

用本研究建立的檢測(cè)方法檢測(cè)206份臨床血清樣本，得到的結(jié)果同商品化的CSFV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(IDEXX)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，比較二者陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總體符合率。

1.5 檢測(cè)豬瘟病毒E0抗體ELISA方法的鑒別應(yīng)用

用建立的ELISA方法和商品化的CSFV E2抗體ELISA試劑盒(MEDIAN/JBT)對(duì)江蘇南京和新疆烏魯木齊地區(qū)免疫E2亞單位疫苗的85份臨床豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒的鑒定

以反轉(zhuǎn)錄獲得的CSFV石門株cDNA為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，從圖1A中可見1條約為681 bp的明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。該片段插入原核表達(dá)載體后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示出1條約為681 bp的目的條帶和1條約為5 370 bp的載體條帶，目的條帶與PCR結(jié)果大小一致(圖1B)。將酶切鑒定成功的質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示目的片段序列正確。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. E0基因；2. pET-28a-E0雙酶切鑒定

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

重組菌株BL21(pET-28a-E0) 擴(kuò)大培養(yǎng)超聲破碎后，分別收取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果如圖2所示，pET-28a-E0蛋白在誘導(dǎo)后的上清和沉淀中都能表達(dá)，但包涵體表達(dá)的含量更高，條帶大小約為28 kDa，與預(yù)期相符。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3.誘導(dǎo)后的上清；2、4.未誘導(dǎo)的上清；5、7.誘導(dǎo)后的包涵體；6、8.未誘導(dǎo)宿主菌裂解物沉淀

IPTG誘導(dǎo)的重組菌沉淀經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別以His標(biāo)簽抗體和標(biāo)準(zhǔn)豬瘟E0陽(yáng)性血清作為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果表明，重組蛋白能特異性地被His標(biāo)簽抗體和豬瘟標(biāo)準(zhǔn)E0陽(yáng)性血清識(shí)別，如圖3所示，28 kDa大小處均出現(xiàn)明亮條帶，最終證明重組蛋白E0成功表達(dá)且具有良好的免疫反應(yīng)性。

A.重組蛋白與His抗體反應(yīng)，其中： M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組E0蛋白；2.CSFV E2蛋白陽(yáng)性對(duì)照；3.空載體蛋白對(duì)照；B.重組蛋白與標(biāo)準(zhǔn)E0陽(yáng)性血清反應(yīng)，其中： M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組E0蛋白；2.空載體蛋白對(duì)照

2.3 目的蛋白純化

將鑒定成功表達(dá)的菌株大量誘導(dǎo)后進(jìn)行超聲破碎，分離上清和沉淀，通過His標(biāo)簽蛋白純化柱純化重組蛋白，用不同濃度咪唑(含有尿素)洗脫純化柱上結(jié)合的蛋白，收集各濃度洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。根據(jù)圖4的SDS-PAGE結(jié)果顯示，在28 kDa處有明顯條帶，與未純化前重組蛋白條帶大小一致。

2.4 最佳抗原包被濃度和一抗血清稀釋倍數(shù)

從表1的結(jié)果中可以看到，當(dāng)?shù)鞍装粷舛葹? μg/mL，一抗稀釋倍數(shù)為100倍時(shí)，P/N值為29.045，顯著高于其他濃度試驗(yàn)組。由此，確定最佳包被濃度為2 μg/mL，一抗最佳稀釋倍數(shù)為100倍。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～8. 咪唑洗滌緩沖液濃度分別為0、20、40、70、100、120、150和200 mmol/L

表1 重組蛋白方陣滴定結(jié)果(OD值)

2.5 最佳一抗血清孵育時(shí)間

根據(jù)表2結(jié)果顯示一抗孵育時(shí)間為45 min和30 min時(shí)的P/N值較高。由于30 min時(shí)的P/N值略高于45 min時(shí)的P/N值，而且更節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，提高試驗(yàn)效率，因此確定最佳一抗孵育時(shí)間為30 min。

表2 不同一抗孵育時(shí)間結(jié)果(OD值)

2.6 二抗最佳稀釋倍數(shù)

用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清按照已確定最佳蛋白包被濃度、一抗稀釋倍數(shù)和一抗反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，將羊抗豬IgG-HRP二抗分別進(jìn)行倍比稀釋后，做3個(gè)重復(fù)。從表3結(jié)果可以看出，二抗進(jìn)行40 000倍稀釋時(shí)，陰陽(yáng)性樣本平均OD值的P/N值較大，因此確定二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶40 000。

2.7 臨界值的確定

用本研究建立的ELISA檢測(cè)方法對(duì)所篩選的30份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，該30份血清樣本OD值平均值(X)為0.043，標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)為0.125，因此X+2SD=0.293，X+3SD=0.418。當(dāng)抗體效價(jià)<0.293時(shí)，樣本判定為陰性；若0.293≤抗體效價(jià)≤0.418時(shí)，判定結(jié)果為可疑；當(dāng)抗體效價(jià)>0.418時(shí)，判定結(jié)果為陽(yáng)性。

表3 不同二抗稀釋倍數(shù)結(jié)果(OD值)

2.8 重復(fù)性檢驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果從表4和表5可以看出，組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。符合精密度標(biāo)準(zhǔn)的要求，說明建立的CSFV E0抗體ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表4 組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 特異性試驗(yàn)

根據(jù)表6結(jié)果顯示，PRRSV、PRV(gE)、PCV2陽(yáng)性血清和CSFV的陰性血清當(dāng)作一抗孵育后的結(jié)果均為陰性，而用CSFV的陽(yáng)性血清孵育結(jié)果為陽(yáng)性，證明本研究建立的方法具有良好的特異性。

表6 重組蛋白特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 符合率測(cè)定

用本研究建立的ELISA方法檢測(cè)采集的206份臨床豬血清，得到的結(jié)果同商品化ELISA試劑盒進(jìn)行比較，結(jié)果見表7。由表7可見，商品化試劑盒的診斷結(jié)果為168份陽(yáng)性樣本，38份陰性樣本；建立的ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為174份陽(yáng)性，32份陰性。2種方法的陽(yáng)性符合率為96.55%，陰性符合率為84.21%，總體符合率為94.17%。說明本研究建立的E0抗體ELISA檢測(cè)方法同商品化試劑盒具有較高的符合率，在臨床應(yīng)用方面具有廣闊的前景。

表7 CSFV E0抗體ELISA檢測(cè)方法與商品化試劑盒診斷結(jié)果的比較

2.11 臨床樣本鑒別診斷

用本研究建立的方法及商品化CSFV E2抗體ELISA試劑盒對(duì)免疫了E2亞單位疫苗的85份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果：商品化E2抗體試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性樣本為78份，陽(yáng)性率為91.76%；本研究建立的方法檢測(cè)陽(yáng)性樣本為9份，陽(yáng)性率為10.59%，表明本研究建立的ELISA方法具有鑒別診斷的優(yōu)點(diǎn)。

3 討論

E0蛋白是CSFV的一個(gè)囊膜糖蛋白，由于其功能性作用廣泛，一直是世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)[10]。E0蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，是建立CSFV血清學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)質(zhì)選擇[11]。在各毒株內(nèi)，E0蛋白的氨基酸序列比編碼E2蛋白的氨基酸序列要更保守，因此E0蛋白可作為防治豬瘟的一個(gè)靶蛋白[12]。另外，E0蛋白作為CSFV的主要免疫性抗原，確保了本研究所建立方法的準(zhǔn)確性。不僅如此，基于E0和E2蛋白建立的豬瘟鑒別診斷方法也得到推廣和應(yīng)用，可以更好地區(qū)分CSFV疫苗毒和野毒感染，以及制定針對(duì)性的豬瘟防控措施以及免疫程序[13]。

本研究選擇了pET-28a載體進(jìn)行E0蛋白的原核表達(dá)，pET-28a載體是一種熱表達(dá)載體，其誘導(dǎo)條件通常為37 ℃。因此，本研究通過在37 ℃誘導(dǎo)經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的重組菌株，使得重組目的蛋白能夠高效表達(dá)，并選擇His標(biāo)簽抗體和豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。成功表達(dá)重組蛋白后，借助His標(biāo)簽蛋白純化柱純化重組蛋白，對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示純化后的蛋白組分更純，濃度更高，具備試驗(yàn)應(yīng)用價(jià)值。本研究利用純化后的CSFV E0蛋白建立了一種方便有效的間接ELISA方法，并對(duì)抗原包被濃度、一抗和二抗的稀釋倍數(shù)與孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)優(yōu)化反應(yīng)條件后的ELISA方法進(jìn)行分析鑒定，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示組間和組內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示本研究建立的ELISA方法只能與CSFV陽(yáng)性血清反應(yīng)，而與其他病毒的陽(yáng)性血清不反應(yīng)。因此，本研究建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性和特異性。與商品化試劑盒的比較，本方法具備良好的符合率。在臨床血清檢測(cè)方面，本方法也顯示出了良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究建立的CSFV E0抗體ELISA檢測(cè)方法具有臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)臨床血清樣本可以進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷。同時(shí)，針對(duì)免疫了豬瘟E2亞單位疫苗的豬瘟豬場(chǎng)，用本研究建立的方法檢出9份E0陽(yáng)性樣本，說明此豬場(chǎng)存在亞單位疫苗免疫豬感染野毒的情況。因此，本研究建立的ELISA方法能夠及時(shí)檢測(cè)出E0抗體(野毒抗體)并完善豬場(chǎng)的免疫程序，初步篩查豬場(chǎng)是否存在野毒感染。