金前躍，王寅彪，柴永笑，盧清俠，郭振華，羅俊，邢廣旭，鄧瑞廣，張改平,6

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3. 江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；5. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；6. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，是感染家禽和野禽的常見病原，一般僅造成輕微癥狀，致病性較強(qiáng)的FAdVs可引起雞包涵體肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)、肌胃糜爛(gizzard erosions，GE)和心包積液綜合征(hydropericardium syndrome，HPS)等[1-2]。FAdV病毒粒子呈球形，直徑70～90 nm，是一種無囊膜雙股線性DNA病毒，基因組全長在40～46 kb，基于全基因組的限制性片段長度多態(tài)性分析及交叉中和試驗(yàn)分別可將FAdVs分為A、B、C、D、E 5個(gè)種，12個(gè)血清型(1～8a，8b～11)[1]。其中，A種包括FAdV-1型，B種包括FAdV-5型，C種包括FAdV-4型和FAdV-10型，D種包括FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9、FAdV-11型，E種包括FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b型。FAdV編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白包括六鄰體蛋白(hexon)、五鄰體蛋白(penton)以及纖維蛋白(fiber)。Hexon蛋白是病毒表面含量最高的蛋白，能夠誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[3-4]?；趆exon基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析常被用于FAdVs的血清型分型，這是因?yàn)橐@得所有血清型FAdV病毒的陽性血清比較困難，交叉中和試驗(yàn)不能被廣泛應(yīng)用[5]。Penton蛋白在病毒入侵細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，也能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[6-7]。Fiber蛋白與penton蛋白非共價(jià)相連，是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的蛋白，能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生，并與病毒的組織嗜性和毒力密切相關(guān)[8]。FAdV的血清A型和C型可編碼2個(gè)fiber蛋白，而血清B型、D型和E型僅編碼1個(gè)fiber蛋白[9]。

2014年以來，F(xiàn)AdV感染引起的IBH和HPS病例在國內(nèi)雞群中不斷出現(xiàn)且呈逐漸增加的趨勢，對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大影響[10-11]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)目前存在著FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E感染，分布在肉雞、蛋雞、鴨、鵝、鴕鳥等禽類群體中[5, 12]。河南的HPS病例于2015年出現(xiàn)在豫東地區(qū)的肉雞群中，目前全省大多數(shù)地區(qū)均有發(fā)生，死亡率達(dá)30%～80%[13-14]。在FAdVs的12個(gè)血清型中，F(xiàn)AdV-4型是引起HPS的主要病原體[15]。本實(shí)驗(yàn)室在2016年從新鄭某雞場采集的HPS病雞樣品中分離獲得了1株禽腺病毒血清4型病毒株，命名為FAdV-4 ZZ株。與無毒力的FAdV-4 ON1和FAdV-4 KR5株相比，F(xiàn)AdV-4 ZZ株存在ORF19、ORF27和ORF30基因缺失。與國內(nèi)最早分離的FAdV-4 JSJ13株相比，F(xiàn)AdV-4 ZZ的ORF29序列存在33 nt核苷酸缺失[11]。FAdV-4 ZZ株的hexon基因與ON1和KR5的hexon基因核苷酸序列相似性分別為98.69%和98.90%；penton基因與ON1和KR5的penton基因核苷酸序列相似性分別為98.99%和98.86%；fiber1基因與ON1和KR5的fiber1基因核苷酸序列相似性分別為95.93%和96.86%；fiber2基因與ON1和KR5的fiber2基因核苷酸序列相似性分別為95.85%和95.90%。這些變異可能說明病毒在進(jìn)一步適應(yīng)宿主，但尚不清楚它們對FAdV-4病毒復(fù)制、毒力及細(xì)胞嗜性的影響。

本研究利用FAdV-4 ZZ病毒株感染SPF雞，對感染后雞的臨床癥狀、存活率、組織病理學(xué)變化、病毒的組織分布情況進(jìn)行了分析，確定了該毒株的致病性，為探索其致病機(jī)制并有效防控HPS病例的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

18日齡的無特定病原體(SPF)雞購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雞肝癌細(xì)胞系(LMH)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(pEASY-Blunt-Hexon)由本實(shí)驗(yàn)室保存。FAdV-4 ZZ株分離于河南鄭州(新鄭)某雞場，利用LMH細(xì)胞穩(wěn)定傳代后保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自Roche公司；病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、PremixExTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；DME/F12培養(yǎng)基購自HyClone公司；組織細(xì)胞固定液、青鏈霉素混合液和胰蛋白酶購自Solarbio公司；胎牛血清購自Gibco公司；0.22 μm濾器購自Merck Millipore公司；QIAamp 96 DNA QIAcube HT Kit購自德國QIAGEN公司。

1.3 病毒的增殖培養(yǎng)

待細(xì)胞瓶中的LMH細(xì)胞生長至約80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，之后接種FAdV-4 ZZ株病毒，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h。然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。-80 ℃與室溫間反復(fù)凍融后，2 000 r/min離心15 min，收集病毒液。過濾后，再次接種于LMH細(xì)胞進(jìn)行傳代，以擴(kuò)增病毒。

1.4 病毒的半數(shù)感染劑量測定

待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的LMH細(xì)胞生長至約80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，向各列細(xì)胞孔中加入100 μL按10-1～10-10連續(xù)10倍倍比稀釋的病毒液，孵育1.5 h后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基，最后2列細(xì)胞孔留作陰性對照，于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，記錄各稀釋度細(xì)胞病變孔數(shù)，使用Reed-Muench法計(jì)算FAdV-4病毒的半數(shù)感染劑量(TCID50)。

1.5 病毒致病性試驗(yàn)

將SPF雞只隨機(jī)分為病毒感染組和PBS對照組，每組各10只。通過肌肉注射給感染組SPF雞注射100 μL的FAdV-4 ZZ株病毒(105.0TCID50/0.1 mL)，PBS對照組以相同方式每只接種100 μL無菌PBS。每日觀察雞的臨床癥狀，剖檢死亡雞，記錄病理變化并采集內(nèi)臟器官。從組織樣品中提取病毒DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測以確定感染后病毒的組織分布情況；同時(shí)采集感染組病死雞和對照組雞的心、肝、脾、肺、腎、腺胃、十二指腸、法氏囊等組織制作病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察各組織的病理學(xué)變化。

1.6 SYBR Green I熒光定量PCR

根據(jù)GenBank中FAdV ZZ株(MN337322.1)的序列，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增hexon基因的SYBR Green I熒光定量PCR引物，上游引物：CGAGGACTACGACGATTA，下游引物：CGTGATACAGCAGGTTAATG，引物由上海生工生物工程公司合成。實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。溶解曲線分析設(shè)置為：95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，結(jié)束。

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，得到109～102拷貝/μL系列標(biāo)準(zhǔn)模板，采用上述反應(yīng)程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品病毒拷貝數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒滴度

將收獲的病毒液做10倍倍比稀釋，感染生長于96孔板中的LMH細(xì)胞，96 h讀數(shù)按照Reed-Muench法得到病毒液的TCID50為107.8TCID50/0.1 mL。

2.2 臨床癥狀

感染后0～24 h，所有SPF雞呈正常狀態(tài)。到48 h 時(shí)，F(xiàn)AdV-4 ZZ株感染組有一半的雞開始出現(xiàn)精神抑郁、嗜睡、食欲不振等癥狀；嚴(yán)重者出現(xiàn)頭首啄地、閉眼不睜、流涎、肛門處羽毛與糞便粘連、綠便等癥狀；隨后48 h內(nèi)，其余雞陸續(xù)出現(xiàn)上述嚴(yán)重癥狀，直至死亡。整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，PBS對照組SPF雞未出現(xiàn)任何異常癥狀。

2.3 攻毒后的存活率

FAdV-4 ZZ株感染組在攻毒后48～60 h間，雞開始死亡，死亡數(shù)占50%；之后，每隔12 h，都有雞死亡，到96 h時(shí)，所有感染雞全部死亡；PBS對照組在整個(gè)試驗(yàn)過程中沒有雞死亡(圖1)。

圖1 攻毒后的雞只存活曲線

2.4 剖檢變化

將PBS對照組正常雞和FAdV-4 ZZ株感染組死亡雞全部進(jìn)行解剖觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAdV-4 ZZ株感染組病死雞全部可見心包積液(圖2A)和肝臟變黃腫大(圖2B)等典型的病理變化；而對照組雞正常，未出現(xiàn)任何病變特征(圖2C)。

2.5 攻毒后的組織病變

經(jīng)HE染色后，與對照組雞相比，感染組病死雞除十二指腸外，各組織均呈現(xiàn)出一定的組織病理學(xué)變化(圖3)。心肌細(xì)胞有壞死現(xiàn)象，肌纖維間出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(圖3A)；肝組織出現(xiàn)彌漫性的灶性壞死，肝細(xì)胞內(nèi)存在包涵體，并且肝細(xì)胞核碎裂、溶解，并伴有散在的炎性細(xì)胞浸潤(圖3B)；脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)點(diǎn)狀凋亡或壞死，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂，但整體結(jié)構(gòu)改變不明顯(圖3C)；肺組織血管內(nèi)可見炎性細(xì)胞增多，肺間質(zhì)出現(xiàn)水腫和少量的炎性細(xì)胞浸潤(圖3D)；腎臟可見廣泛彌漫性的腎小管上皮細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松(圖3I)；腺胃可見排列規(guī)則整齊的復(fù)合管狀腺，復(fù)合管腺腔內(nèi)可見少量的滴狀物，腺管上皮細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死(圖3J)；十二指腸腸黏膜層絨毛排列整齊規(guī)則，腸腺豐富，排列規(guī)則，腸各層結(jié)構(gòu)清晰緊密，未見明顯異常(圖3K)；法氏囊胸腺小葉結(jié)構(gòu)尚在，小葉中皮髓質(zhì)分界不清楚，皮髓質(zhì)中淋巴細(xì)胞大量壞死減少，排列稀疏紊亂，并伴有中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(圖3L)。

圖2 FAdV-4 ZZ株感染雞的病理變化

圖3 FAdV-4 ZZ株感染雞不同組織的組織學(xué)變化(HE染色，20×)

2.6 病毒的組織分布情況

熒光定量PCR檢測各組織的病毒載量后發(fā)現(xiàn)，感染組病死雞的心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、腺胃和心包積液中，都存在不同程度的病毒感染，肝組織中病毒載量最高，其次為肺，表明FAdV-4 ZZ株病毒具有廣泛的組織嗜性(圖4)。

圖4 FAdV-4 ZZ株感染后不同組織中的病毒載量

3 討論

2014年以來，國內(nèi)雞群陸續(xù)出現(xiàn)了IBH和HPS病例，多發(fā)于5～11周齡，蛋雞、肉種雞和三黃雞都有發(fā)病[13,16]。發(fā)病雞剖檢后心包腔內(nèi)有淡黃色積液，同時(shí)出現(xiàn)肺水腫、肝臟腫脹變色等病變。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)引起國內(nèi)IBH病例的禽腺病毒為FAdV-8a/b型，引起HPS病例的禽腺病毒為FAdV-4型[16]。FAdV既可經(jīng)雞胚垂直傳播，也可經(jīng)糞口途徑水平傳播，從而對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大影響[17]。劉亮亮等[18]研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)商品化的新城疫弱毒苗中污染了FAdV-4型病毒，可能造成雞群大面積感染。Pan等[19]研究發(fā)現(xiàn)感染FAdV-4的鴨群可以不表現(xiàn)臨床癥狀，但能持續(xù)排毒，形成潛在的傳染源，病毒從鴨群向雞群傳播加大了HPS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和防控難度。

本實(shí)驗(yàn)室2016年從患有HPS的病雞樣品中分離了1株FAdV-4病毒株(FAdV-4 ZZ株)，利用LMH細(xì)胞對病毒進(jìn)行了培養(yǎng)，并獲得了病毒的全基因組序列(GenBank登錄號(hào)：MN337322.1)，研究發(fā)現(xiàn)FAdV-4 ZZ株能夠影響雞胚發(fā)育，造成內(nèi)臟器官產(chǎn)生病變并使雞胚死亡。在此基礎(chǔ)上，本研究以FAdV-4 ZZ株感染SPF雞只，從存活率、剖檢結(jié)果、組織病理學(xué)變化、病毒的組織分布情況等方面對病毒的致病力進(jìn)行了評價(jià)。

FAdV-4 ZZ株感染SPF雞96 h后，所有感染雞全部死亡。這說明FAdV-4 ZZ株對SPF雞有高致病性，與國內(nèi)其他FAdV-4分離株的致死性結(jié)果相近[20]。剖檢發(fā)現(xiàn)感染組病死雞全部出現(xiàn)心包積液和肝臟變黃腫大等典型的病理變化，組織病理學(xué)也出現(xiàn)了HPS的典型變化。熒光定量PCR檢測顯示肝臟病毒載量最高，其他組織也檢測到不同程度的病毒存在，表明FAdV-4 ZZ株病毒具有廣泛的組織嗜性。與國內(nèi)其他FAdV-4分離株感染SPF雞后的組織病毒載量結(jié)果相似[19-20]。

FAdV感染一般僅造成亞臨床癥狀，本研究致病性試驗(yàn)獲得的臨床癥狀、存活率、剖檢結(jié)果、病理學(xué)變化、病毒組織分布情況等結(jié)果表明FAdV-4 ZZ株對雞群具有高毒力，這與國內(nèi)其他FAdV-4分離株也具有高致病性的結(jié)論一致[11,21-22]。與無毒力的FAdV-4 ON1和FAdV-4 KR5株相比，F(xiàn)AdV-4 ZZ株存在ORF19、ORF27和ORF30基因缺失。與國內(nèi)最早分離的FAdV-4 JSJ13株相比，F(xiàn)AdV-4 ZZ的ORF29序列存在33 nt核苷酸缺失[11]。深入研究這些基因變異對FAdV-4毒力增強(qiáng)產(chǎn)生的影響，是研發(fā)FAdV疫苗的關(guān)鍵。當(dāng)前，加強(qiáng)養(yǎng)禽場生物安全、防止病毒在禽類群體中因交叉感染而持續(xù)存在，同時(shí)保障禽類疫苗中不污染FAdV，尤其是FAdV-4，是防控FAdV感染和HPS病例發(fā)生的重要措施。