倪珺，雷詩敏，羅麗平，謝國玉，劉序，芮榮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

子宮疾病是危害犬類健康與繁殖性能的臨床常見疾病，嚴(yán)重者甚至威脅生命。近年來，我國寵物行業(yè)發(fā)展迅速，寵物犬飼養(yǎng)數(shù)量不斷增加，犬的健康日益受到寵物主人的重視。眾所周知，大多數(shù)子宮病變均與激素失調(diào)和細(xì)菌感染有關(guān)，而母犬生殖生理特點使其更易受微生物感染，引發(fā)生殖系統(tǒng)疾病[1]，其中子宮蓄膿發(fā)病率較高、危害較大，不及時治療可能引發(fā)母犬死亡，研究犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的變化對闡明子宮疾病的發(fā)病機制具有重要意義。培養(yǎng)犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，可為了解犬子宮內(nèi)膜病變過程中基質(zhì)細(xì)胞的生長代謝、相互作用和內(nèi)分泌調(diào)控等提供有益的體外模型，國內(nèi)有關(guān)犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)鮮有報道。本試驗旨在通過優(yōu)化基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)程序，以期提高犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的純度和成功率，為進(jìn)一步探討犬子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供有價值的體外細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 子宮組織樣本的來源

2018年9月至2019年12月從南京數(shù)家寵物醫(yī)院采集2～8歲進(jìn)行子宮卵巢摘除術(shù)的健康犬子宮，摘取的子宮樣本立即放入4 ℃含雙抗(100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)生理鹽水中，2 h內(nèi)送達(dá)實驗室進(jìn)行分離培養(yǎng)操作。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、臺盼藍(lán)均購自美國Sigma公司；100×青霉素-鏈霉素溶液購自Biosharp公司。鼠抗人波形蛋白(vimentin)抗體、鼠抗人細(xì)胞角蛋白(cytokeratin-18，CK-18)抗體購自北京Bioss公司。

1.3 犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)

1.3.1 子宮組織樣本的處理

在超凈臺內(nèi)無菌操作，先將子宮樣本移至滅菌燒杯中，剪除子宮周圍結(jié)締組織和脂肪，用含雙抗生理鹽水沖洗子宮外部血液等。沖洗干凈后，移至另一潔凈無菌平皿中，從一側(cè)子宮角沿子宮外壁縱向剖開，暴露子宮內(nèi)腔，將內(nèi)膜面展平在無水乙醇中浸泡30 s。PBS沖洗除去乙醇，用眼科鑷剝離子宮內(nèi)膜，放入含PBS小玻璃瓶中，剪成約1 mm3組織塊。PBS清洗血液至液體清亮。

1.3.2 膠原酶消化處理

剪碎的組織塊移至10 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，除去上清后加入3倍組織體積的不同濃度Ⅰ型膠原酶(分別為0.5%，0.25%和0.125%)，搖勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 min至4 h，為使消化液與組織密切接觸，每隔10 min取出震蕩1次。組織消化完畢后加入適量DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋，反復(fù)吹打懸液，分別經(jīng)100目、400目細(xì)胞網(wǎng)篩濾去未消化的組織和上皮細(xì)胞團塊。收集濾液1 500 r/min 離心10 min，棄上清，所獲細(xì)胞沉淀即為基質(zhì)細(xì)胞。用適量10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍(lán)計數(shù)以(3～5)×105個/mL密度鋪于細(xì)胞瓶中，輕輕搖晃均勻，置于38.5 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換新鮮培養(yǎng)液，除去未貼壁組織細(xì)胞，之后每2 d換液1次。

1.4 犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與純化

與上皮細(xì)胞相比，基質(zhì)細(xì)胞在傳代過程中更易被胰蛋白酶消化脫壁，再次貼壁也更快。根據(jù)這種特性，采取差時貼壁法在傳代培養(yǎng)時純化細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，原代犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長3～4 d鋪滿瓶底即能進(jìn)行傳代；細(xì)心倒去舊上清培養(yǎng)液，用預(yù)熱38.5 ℃ PBS洗3次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液(含0.02% EDTA)，輕輕晃動細(xì)胞瓶，使酶溶液與細(xì)胞面充分接觸。顯微境下觀察細(xì)胞變化，直至大部分成纖維樣細(xì)胞收縮變圓后，立即加入等量完全培養(yǎng)基(含10% FBS)終止消化，收集消化液1 000 r/min 離心5 min，沉淀重懸，按3×105個/mL細(xì)胞密度移入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后大部分基質(zhì)細(xì)胞已貼壁，棄去上清培養(yǎng)液，添加新鮮培養(yǎng)液，即可得到進(jìn)一步純化的基質(zhì)細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，用作細(xì)胞觀察與鑒定。

1.5 犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的觀察與鑒定

1.5.1 基質(zhì)細(xì)胞的顯微鏡觀察

倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞不同階段的生長狀態(tài)和記錄其形態(tài)學(xué)特點。

1.5.2 免疫熒光化學(xué)鑒定細(xì)胞表型及純度

在6孔培養(yǎng)板中放入圓形玻片，P3代犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞接種于上述培養(yǎng)板中，細(xì)胞爬片培養(yǎng)2～3 d至幾乎全部覆蓋玻片，PBS小心清洗2次，用4%多聚甲醛常溫固定30 min。PBS吹打洗滌3次，0.1% TritonX-100孵育15 min，PBS洗滌3次，BSA室溫封閉30 min后加入一抗(鼠抗人波形蛋白vimentin的工作濃度為1∶200，鼠抗人細(xì)胞角蛋白CK-18的工作濃度為1∶200)，4 ℃過夜，滴加Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗(工作濃度為1∶100)，避光室溫孵育1 h。DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min?？篃晒獯銣鐒┓馄?，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每張細(xì)胞片低倍鏡下隨機選取10個視野計數(shù)細(xì)胞。

1.6 MTT檢測基質(zhì)細(xì)胞增殖情況

每隔3代(P3、P6、P9、P12)用MTT法檢測犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖狀況并繪制細(xì)胞生長曲線。96孔板內(nèi)接種細(xì)胞(1×105個/mL)，設(shè)置6個復(fù)孔，于38.5 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8 d。每天觀測細(xì)胞生長狀態(tài)并采用MTT法檢測，讀取各孔在波長570 nm處的OD值。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 凍存前后基質(zhì)細(xì)胞存活率測定

將凍存前和解凍后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入等體積0.4%臺盼藍(lán)染色3 min，混合均勻取10 μL沿蓋玻片邊緣滴入血球計數(shù)板小室，顯微鏡下觀察計數(shù)?；罴?xì)胞透亮，死細(xì)胞因細(xì)胞膜通透性改變而被染成藍(lán)色。隨機選取視野，分別記錄細(xì)胞數(shù)，計算活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為細(xì)胞活率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析處理，P<0.05表示差異顯著，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度膠原酶的細(xì)胞消化效果

剪碎組織中加入不同濃度的膠原酶Ⅰ置于37 ℃培養(yǎng)箱作用一段時間，觀察組織的消化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.125%膠原酶Ⅰ作用1 h，液體輕度渾濁；作用2 h，組織邊緣飄出絮狀物；作用4 h左右時，組織幾乎酶解，液體為稀糊狀，易于過濾。0.25%膠原酶Ⅰ作用1 h，組織開始疏松；作用2 h左右，組織全部被酶解，液體較黏稠，較難過濾。0.5%膠原酶Ⅰ作用30 min，組織疏散成絮狀；作用1 h時組織已被酶解，液體呈糊狀，黏度高，難過濾。每隔10 min振蕩消化液，根據(jù)消化狀態(tài)靈活把控消化時間，3種酶濃度都可獲得活力較好的細(xì)胞。因體外分離細(xì)胞的過程較長，為節(jié)約試驗時間，選用0.5%Ⅰ型膠原酶消化培養(yǎng)60 min左右，消化完畢的消化液加入適量DMEM/F12稀釋，以便于網(wǎng)篩過濾。

2.2 基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成功率與細(xì)胞產(chǎn)量

試驗成功分離培養(yǎng)出犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)成功率較高，但從寵物醫(yī)院運輸?shù)綄嶒炇視r間較久的樣本分離培養(yǎng)的細(xì)胞存活率低或極易發(fā)生污染。試驗發(fā)現(xiàn)，處于不同發(fā)情狀態(tài)的母犬子宮分離得到的基質(zhì)細(xì)胞也有差異。絕大多數(shù)做絕育手術(shù)的母犬處于發(fā)情期，子宮角細(xì)長，子宮內(nèi)膜潮紅，內(nèi)腔黏液較少，其原代分離培養(yǎng)得到的基質(zhì)細(xì)胞易貼壁生長，細(xì)胞產(chǎn)量高。間情期的母犬子宮松弛，子宮角較粗，剖開后內(nèi)腔黏液較多，原代分離培養(yǎng)得到的基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)不佳，不易貼壁，污染幾率較高，常常導(dǎo)致分離培養(yǎng)失敗。母犬發(fā)情期和間情期子宮經(jīng)原代分離培養(yǎng)所獲基質(zhì)細(xì)胞平均活率測定結(jié)果見表1。

表1 母犬不同生理階段子宮原代分離的基質(zhì)細(xì)胞平均活率%

由表1可見，原代培養(yǎng)24 h和48 h后，分別對發(fā)情期和間情期的犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行活率檢測，結(jié)果表明發(fā)情期的犬子宮經(jīng)原代分離培養(yǎng)所獲的細(xì)胞活率均顯著高于間情期(P<0.05)。

2.3 基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征

原代培養(yǎng)的犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞接種3 h左右開始貼壁，12 h基本貼壁完全，以(3～5)×105個/mL密度接種3 d接近鋪滿。倒置顯微鏡下觀察顯示，培養(yǎng)24 h的犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞開始延伸生長，細(xì)胞薄而扁平，多數(shù)細(xì)胞呈三角型或星型(圖1A)；48 h時細(xì)胞伸長為梭形或放射狀，胞漿豐富而透明(圖1B)。

A.培養(yǎng)24 h(400×); B.培養(yǎng)48 h(100×)

用添加0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液作細(xì)胞傳代培養(yǎng)，消化的最適作用時間為3 min，此時可見大部分梭形細(xì)胞收縮脫壁。傳代后的基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不變，生長迅速(圖2A)，48 h左右基本匯合，細(xì)胞之間平行排列或呈漩渦狀分布(圖2B)。隨著傳代次數(shù)的增多，基質(zhì)細(xì)胞的純度也越來越高，但12代之后細(xì)胞逐漸生長緩慢，至19代時細(xì)胞幾乎不再生長。

A.培養(yǎng)24 h(200×);B.培養(yǎng)48 h(100×)

2.4 基質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定

將CK-18和vimentin 2種特異性標(biāo)志分子對體外分離的犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，即可判定細(xì)胞表型及純度。結(jié)果表明，傳代的基質(zhì)細(xì)胞多呈長梭形，以vimentin染色陽性(胞漿內(nèi)見紅色熒光標(biāo)記)，CK-18染色陰性(胞漿內(nèi)無或弱綠色熒光標(biāo)記)，證實培養(yǎng)的細(xì)胞為基質(zhì)細(xì)胞(圖3)。Vimentin陽性細(xì)胞率為(93.10±0.59)%，分離的基質(zhì)細(xì)胞純度在92%～95%。

圖3 犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定(比例尺=50 μm)

2.5 基質(zhì)細(xì)胞生長曲線的繪制

犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)“S”型，接種后有1 d適應(yīng)期，P3、P6、P9代細(xì)胞在培養(yǎng)第2天進(jìn)入指數(shù)增長期，5 d以后細(xì)胞逐漸減少；P12代細(xì)胞推遲1 d進(jìn)入指數(shù)增長期，細(xì)胞生長緩慢，由此可見，隨著傳代次數(shù)增多，犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力逐漸下降。P3、P6、P9細(xì)胞生長速率基本接近，處于增殖旺盛階段，符合正常的分裂增殖特性。

圖4 犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生長曲線

2.6 基質(zhì)細(xì)胞凍存前后的存活率

分別解凍P3、P6、P9代細(xì)胞，檢測凍存前后的細(xì)胞活率見表2。P3、P6、P9代細(xì)胞凍存前均有較高的存活率，解凍后P9代細(xì)胞存活率相比前兩者顯著降低(P<0.05)。

表2 犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凍存前后的平均細(xì)胞活率 %

3 討論

犬與其他哺乳動物有著不同的生殖生理特點，卵泡在發(fā)情排卵后逐漸黃體化，血液中雌激素水平下降，孕酮水平逐漸增加，并且體內(nèi)的高濃度孕酮一直會持續(xù)到間情期[2]。有研究表明，母犬發(fā)情后期和間期升高的孕酮含量和降低的雌激素含量會引起子宮內(nèi)膜腺囊性增生，并影響其白細(xì)胞抗感染能力[3]，蓄積的腺體分泌物和低下的自身免疫力造成了利于細(xì)菌繁殖的子宮內(nèi)環(huán)境，這意味著母犬比其他動物更容易感染子宮疾病。子宮內(nèi)膜主要是由基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞組成，而增生期的子宮內(nèi)膜以基質(zhì)細(xì)胞為主[4]。為研究基質(zhì)細(xì)胞的生理功能，本試驗優(yōu)化了犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)程序，為研究子宮原位的作用機制、分析細(xì)胞間相互聯(lián)系及細(xì)菌的侵襲過程、研究性激素的調(diào)節(jié)作用等提供了理想的細(xì)胞模型。

絕育母犬的子宮組織離開體內(nèi)后，易受到外界細(xì)菌的污染而可能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，因此取材必需在手術(shù)過程中無菌獲得，并保持低溫運輸盡快送達(dá)實驗室。試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)情期子宮樣本較間情期樣本所獲細(xì)胞原代培養(yǎng)更易貼壁，生長狀態(tài)更好，間情期子宮樣本原代培養(yǎng)過程狀態(tài)不佳，且容易發(fā)生污染。據(jù)報道，人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞易受到陰道細(xì)菌污染而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[5]，奶牛處于間情期的子宮分離培養(yǎng)所獲內(nèi)膜細(xì)胞活力較低[6]。這一發(fā)現(xiàn)推測與間情期雌性體內(nèi)異常的性激素水平有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞大小、形態(tài)及特性發(fā)生變化或子宮免疫功能降低而未能清除內(nèi)膜上入侵的細(xì)菌。本試驗所取內(nèi)膜多為發(fā)情期內(nèi)膜，內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞含量更高，為降低間情期子宮內(nèi)膜分離培養(yǎng)的失敗率，適當(dāng)增加了洗滌液及培養(yǎng)液中的青霉素、鏈霉素濃度，以最大程度減少污染。

本試驗對犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考人[7]和各種動物的研究方法[8-12]，并對宗振平等[13]和Bartel等[14]的方法加以摸索和改良。目前，子宮內(nèi)膜的分離主要采用酶消化法，酶的種類、濃度、作用時間因動物不同、細(xì)胞不同而異，酶消化法又分膠原酶消化法、胰蛋白酶消化法和混合酶消化法。前期經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶對犬子宮內(nèi)膜消化效果較差，消化時間短則組織塊未被完全消化，時間長則液體十分黏稠，難以過濾，且對細(xì)胞作用強、損傷大，得到的細(xì)胞量很少，而用膠原酶對細(xì)胞的影響較小，獲得的細(xì)胞易分散、活力更強，因此試驗直接用膠原酶持續(xù)消化。本研究用0.125%、0.25%、0.5%Ⅰ型膠原酶分別對組織作用消化，觀測消化時間和消化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.125% Ⅰ型膠原酶也可取得較好的消化效果，且消化液易于過濾，但需消化4 h以上； 0.5% Ⅰ型膠原酶在較短的時間內(nèi)可獲得了較多的細(xì)胞，且不影響細(xì)胞的活性；0.25% Ⅰ型膠原酶的消化效果處于兩者之間。此外，需要把控好組織與消化酶的體積比(1∶3)，盡量剪碎內(nèi)膜組織可減少消化酶作用時間，防止因消化酶添加過多或組織量大加長消化時間而導(dǎo)致過度消化，從而影響細(xì)胞的活力和貼壁情況。由于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)步驟較多，操作時間較長，對細(xì)胞存活易產(chǎn)生不良影響，為了縮短細(xì)胞在體外的分離時間，減少污染概率，試驗選擇0.5% Ⅰ型膠原酶，對黏稠的消化液適當(dāng)稀釋以便于更快過濾，增加活細(xì)胞的比例。

網(wǎng)篩過濾法是一種常用的組織細(xì)胞分離法[8，15]，根據(jù)上皮細(xì)胞體積大且易成團而基質(zhì)細(xì)胞體積小且易貼壁的特點，采用100目和400目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾去除未被消化組織和腺上皮細(xì)胞團，濾液離心即可獲得較純的基質(zhì)細(xì)胞懸液，以較高的密度接種可增加細(xì)胞間的相互支持，降低培養(yǎng)失敗的概率。再根據(jù)原代上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的貼壁時間差異進(jìn)行二次分離純化，腺上皮細(xì)胞貼壁時間較長，一般36 h后才可以首次換液，因此接種細(xì)胞24 h時需及時換液以除去上皮細(xì)胞，提高基質(zhì)細(xì)胞的純度。依然混雜在基質(zhì)細(xì)胞中的上皮細(xì)胞，可根據(jù)兩者對胰蛋白酶的敏感性不同，采用多次差時消化法純化出基質(zhì)細(xì)胞，即使還有少量的腺上皮細(xì)胞也會因為不能耐受傳代而被除去。

試驗分離得到的犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，傳代細(xì)胞的生長速率比原代細(xì)胞快，第2天即進(jìn)入對數(shù)生長期。P9代之前基質(zhì)細(xì)胞增殖能力較強，冷凍后也有較高的存活率，細(xì)胞穩(wěn)定性好，可在體外生長至19代。犬原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程不改變細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)，因而可采用針對基質(zhì)細(xì)胞抗原的特異性抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫鑒定。許多學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞角蛋白只在腺上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，vimentin在基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞中均可表達(dá)，因此，僅vimentin不能作為鑒別基質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞的依據(jù)[16-18]。利用角蛋白和波形蛋白抗體檢測和計數(shù)分析表明，試驗培養(yǎng)的離體細(xì)胞確為基質(zhì)細(xì)胞，可以達(dá)到92%～95%的細(xì)胞純度，可用作進(jìn)一步的試驗研究。

子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞是激素作用的靶器官，其分泌功能也十分復(fù)雜[19]。Wang 等[20]對人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)孕酮處理會促進(jìn)免疫細(xì)胞群募集和血管生成，這對于成功懷孕至關(guān)重要；子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分泌的甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白可以作用于骨骼、腎臟等器官，有助于鈣的傳送[21]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞還可以表達(dá)大量細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、集落刺激因子(CSF1)、腫瘤壞死因子α (TNFα)等[22]，這些生長因子可維持機體的正常生命活動。研究發(fā)現(xiàn)孕酮可通過增強成纖維生成因子(FGF)的表達(dá)使小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞G1期延長,在此期間如果受到合適的介質(zhì)刺激即開始分化[23]；犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞受大腸桿菌和脂多糖刺激后，細(xì)胞因子IL-8、CXCL5和CXCLl0分泌增加，對炎性部位嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的募集發(fā)揮重要作用[18]。因此子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞同細(xì)胞因子的關(guān)系極為密切。

子宮內(nèi)膜細(xì)胞在體內(nèi)受內(nèi)分泌環(huán)境等多種因素的調(diào)節(jié)，妨礙了對單一細(xì)胞的關(guān)鍵性分析。因此，體外分離純化具有同一性的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞是研究其生長代謝、激素作用以及免疫機理的重要環(huán)節(jié)。本試驗優(yōu)化了細(xì)胞分離步驟，提高了細(xì)胞產(chǎn)量，對犬繁殖生理與疾病的研究具有重要意義，為研究犬子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病提供了理想的細(xì)胞模型。